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Jul 17, 2023

MOG-Analoga zur Erforschung des MCT2-Pharmakophors α

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 877 (2022) Diesen Artikel zitieren 1378 Zugriffe 1 Zitate 12 Details zu altmetrischen Metriken Eine Verlagskorrektur zu diesem Artikel wurde am 27. veröffentlicht

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α-Ketoglutarat (αKG) ist ein zentraler Stoffwechselknoten mit weitreichendem Einfluss auf die Zellphysiologie. Das αKG-Analogon N-Oxalylglycin (NOG) und sein membrandurchlässiges Prodrug-Derivat Dimethyloxalylglycin (DMOG) wurden in großem Umfang als Hilfsmittel zur Untersuchung von Prolylhydroxylasen (PHDs) und anderen αKG-abhängigen Prozessen eingesetzt. In Zellkulturmedien wird DMOG schnell in MOG umgewandelt, das über den Monocarboxylattransporter MCT2 in die Zellen gelangt, was zu intrazellulären NOG-Konzentrationen führt, die ausreichend hoch sind, um Glutaminolyseenzyme zu hemmen und Zytotoxizität zu verursachen. Daher bestimmt der Grad der (D)MOG-Instabilität zusammen mit den MCT2-Expressionsniveaus die intrazellulären Ziele, mit denen NOG interagiert, und letztendlich seine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Hier haben wir eine Reihe von MOG-Analoga entworfen und charakterisiert mit dem Ziel, die Stabilität der Verbindung zu verbessern und die funktionellen Anforderungen für die Interaktion mit MCT2, einem relativ wenig erforschten Mitglied der SLC16-Familie, zu untersuchen. Wir berichten über MOG-Analoga, die die Fähigkeit aufrechterhalten, über MCT2 in Zellen einzudringen, und identifizieren Verbindungen, die die Glutaminolyse nicht hemmen oder Zytotoxizität verursachen, aber dennoch PHDs hemmen können. Wir verwenden diese Analoga, um zu zeigen, dass unter unseren experimentellen Bedingungen die Glutaminolyse-induzierte Aktivierung von mTORC1 von der PHD-Aktivität abgekoppelt werden kann. Daher können diese neuen Verbindungen dazu beitragen, zelluläre Effekte zu entschlüsseln, die aus der polypharmakologischen Wirkung von NOG resultieren.

Die Untersuchung des Stoffwechsels wird seit langem durch die Verwendung von Metabolitenanaloga unterstützt, die die schnelle und reversible Hemmung von Enzymen und Signalwegen in verschiedenen experimentellen Umgebungen ermöglichen1. Im Bereich des Krebsstoffwechsels ergänzen analoge Verbindungen wie 2-Desoxyglucose, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) und Dichloracetat (DCA) weiterhin genetische Ansätze zur Analyse der Stärken und Schwachstellen, die mit onkogengesteuerten Erkrankungen verbunden sind Stoffwechselveränderungen in Tumoren2,3,4. Metabolit-Analoga gehören auch zu den wichtigsten klinisch eingesetzten chemotherapeutischen Verbindungen: von Gemcitabin und 5-Fluor-Uracil (5-FU), Nukleosid-Analoga, die zur Therapie von Bauchspeicheldrüsen- und Darmkrebs eingesetzt werden; zu Methotrexat und Pemetrexed, Folat-Analoga, die zur Behandlung einer Reihe von bösartigen Erkrankungen verabreicht werden5,6. Die Entwicklung und Verfeinerung von Metabolit-Analoga kann daher wertvolle Werkzeuge für mechanistische Studien sowohl des Stoffwechsels als auch der Tumorentstehung liefern.

α-Ketoglutarat (αKG) ist ein wichtiger Stoffwechselknoten und das Verständnis seiner komplexen Biologie wurde durch das Strukturanalogon N-Oxalylglycin (NOG) erleichtert, das zusammen mit seinem zellpermeablen Derivat Dimethyloxalylglycin (DMOG) in vitro häufig verwendet wurde )7,8,9 (Abb. 1a). Am häufigsten wird DMOG verwendet, um Hypoxiesignale auszulösen, indem es Enzyme der Prolylhydroxylasedomäne (PHD) hemmt, was zur Stabilisierung des Transkriptionsfaktors Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF1α)8,10 führt. Die HIF1α-Stabilisierung ist ein therapeutisches Ziel bei Erkrankungen, die von Ischämie und Anämie bis hin zu entzündlichen Erkrankungen reichen11,12, und in diesen Situationen haben frühere Studien DMOG verwendet, um den potenziellen therapeutischen Nutzen der Hemmung von PHDs zu demonstrieren13,14.

ein Schema (erstellt mit Biorender), das die chemischen Strukturen von DMOG, MOG und NOG, ihre relative Zellpermeabilität und zelluläre Ziele in Abhängigkeit von den intrazellulären NOG-Konzentrationen ([NOG]IC) darstellt, die sie hervorrufen). DMOG wird in MOG und anschließend in das aktive αKG-Analogon NOG umgewandelt. DMOG ist zelldurchlässig, während MOG über MCT2 transportiert wird, was zu einem höheren [NOG]IC im Vergleich zu dem durch DMOG hervorgerufenen führt. Hoher [NOG]IC hemmt zusätzlich zu den PHDs auch Stoffwechselenzyme. NOG kann die Plasmamembran nicht passieren. b Analyse der Stabilität von synthetischem MOG im Zeitverlauf in Vollblut von Mäusen mittels LC-MS (n = 3 technische Replikate). c LC-MS-Analyse der DMOG-Stabilität in Vollblut von Mäusen im Zeitverlauf (n = 3 technische Replikate). DMOG wird sehr schnell in MOG umgewandelt, das ebenfalls instabil ist und anschließend NOG mit einer ähnlichen Kinetik wie das in (b) gemessene synthetische MOG bildet. Die Tabelle zeigt die berechneten Halbwertszeiten der DMOG-Umwandlung in MOG und anschließend NOG oder der synthetischen MOG-Umwandlung in NOG aus den in den Feldern (b und c) gezeigten Daten. d Strukturen von MOG-Glycinatmethylester-Ersatzanaloga, die in dieser Arbeit entworfen, synthetisiert und beschrieben wurden. (i) sperrigere Alkylester (2,3), (ii) α-Methylsubstituenten (4–6), (iii) Ketonanalogon (7), (iv) 5-gliedrige aromatische Heterocyclen (8–10). e Syntheseweg zur Herstellung der MOG-Analoga 2–10, dargestellt in Panel (d).

αKG ist nicht nur ein Cofaktor für αKG-abhängige Enzyme, sondern auch der Eintrittspunkt für Glutaminkohlenstoffe in den TCA-Zyklus, ein Substrat für eine große Anzahl von Transaminasereaktionen, und es wurde auch gezeigt, dass es die Aktivierung des mechanistischen Ziels von vermittelt Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) durch Glutamin15. αKG kann epigenetische Profile während der Entwicklung9 und in pathogenen Kontexten16 verändern, indem es Ten-Eleven-Translokations(TET)-Hydroxylasen und Jumonji-Demethylasen reguliert. Darüber hinaus kann αKG über einen noch unklaren Mechanismus die Alterung beeinflussen17, was zeigt, dass über die physiologischen Funktionen dieses Metaboliten noch viel zu entdecken ist.

Obwohl DMOG in der Lage ist, PHDs zu hemmen und dadurch HIF1α in einer Vielzahl von Zelllinien zu stabilisieren, ist es für einige selektiv toxisch, und zwar in einer Weise, die stark mit dem Expressionsniveau des Monocarboxylattransporters MCT218, einem Mitglied der SLC16-Transporterfamilie, korreliert . DMOG ist in Zellkulturmedien instabil und wird nicht enzymatisch in das Monocarboxylat Methyloxalylglycin (MOG) mit einer Halbwertszeit von 10 Minuten umgewandelt. MOG ist ein Substrat für MCT2, dessen Expression die Konzentration von NOG bestimmt, das sich intrazellulär ansammelt ([NOG]IC). In Zellen mit hoher MCT2-Expression kann [NOG]IC millimolare Werte erreichen, die hoch genug sind, um zusätzlich niederaffine αKG-bindende Enzyme wie Isocitratdehydrogenase (IDH) und Glutamatdehydrogenase (GDH) zu aktivieren, was zu schwerwiegenden Stoffwechselstörungen führt Zytotoxizität. Eine solche polypharmakologische Wirkungsweise macht es schwierig, die genauen Mechanismen zu entschlüsseln, die für die Auswirkungen von NOG auf die Zellphysiologie verantwortlich sind.

Zusätzlich zu MOG transportiert MCT2 endogene Monocarboxylate von Pyruvat und Laktat zu größeren Ketonkörpern wie β-Hydroxybutyrat, Acetoacetat, α-Ketoisovalerat und α-Ketoisocaproat (ergänzende Abbildung 1a) mit einer höheren Affinität als die anderen Mitglieder der SLC16-Familie. MCT2 spielt wichtige physiologische Rollen, einschließlich der Aufnahme von Astrozyten-sekretiertem Laktat in Neuronen im Gehirn20,21. MCT2 wird bei einigen Krebsarten beim Menschen stark exprimiert (ergänzende Abbildung 1b) und wurde als Biomarker für Prostatakrebs vorgeschlagen22 und spielt bei Brustkrebs eine protumorigene23 und prometastatische24 Rolle. Daher besteht ein wachsender Bedarf an der Entwicklung chemischer Sonden zur Untersuchung der MCT2-Funktionen.

Hier berichten wir über das Design und die Synthese von MOG-basierten Analoga und verwenden sie, um das MCT2-Pharmakophor und die [NOG]IC-abhängige Interferenz mit intrazellulären Zielen im Zusammenhang mit ihren Auswirkungen auf die Zellproliferation und das Überleben zu untersuchen.

Basierend auf unseren früheren Erkenntnissen18 kamen wir zu dem Schluss, dass MOG als Gerüst verwendet werden könnte, um sowohl den von MCT2 abgedeckten chemischen Raum als auch die zellulären Rollen von αKG-bindenden Proteinen zu untersuchen. Die Umwandlung von DMOG in MOG und anschließend in NOG erzeugt Verbindungen mit zunehmend verringerter Fähigkeit, die Plasmamembran zu durchdringen (Abb. 1a), sodass die Stabilität von MOG und damit auch die seiner Analoga deren Eintrittsart in die Zellen beeinflussen könnte und anschließend der Grad der intrazellulären Zieleingriffe. Mit der Aussicht, Verbindungen zu generieren, die in Zukunft auch für Studien in vivo verwendet werden könnten, haben wir daher zunächst die Stabilität von MOG im Vollblut von Mäusen mithilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) bestimmt.

Synthetisches MOG wurde mit einer kurzen Halbwertszeit in NOG umgewandelt, die mit der von MOG vergleichbar war, das vorübergehend aus DMOG erzeugt wurde (Abb. 1b, c). Bemerkenswert ist, dass der Abbau von DMOG zu MOG mit einer Halbwertszeit von nur 0,61 Minuten sogar noch schneller erfolgte. Die Halbwertszeiten von DMOG und MOG im Blut von Mäusen sind deutlich kürzer als die zuvor in wässriger Lösung gemessenen18, was wir auf die gut dokumentierte hohe Blutesteraseaktivität zurückführen. Diese Daten legen nahe, dass eine erhöhte Stabilität eine wünschenswerte Eigenschaft von MOG-Analoga wäre.

Wir haben Verbindungen mit MOG als chemischem Gerüst entworfen und synthetisiert (1, Abb. 1d, e). Basierend auf unseren bisherigen Erkenntnissen und der Tatsache, dass Ester typischerweise als Prodrugs für schlecht absorbierte Carbonsäure-Medikamente verwendet werden25,26,27,28, haben wir uns auf den Methylester von MOG als Hauptursache für die Instabilität der Verbindung im Plasma konzentriert. Da darüber hinaus das für den MCT2-gesteuerten Transport erforderliche Pharmakophor unbekannt ist, wurden die Substitutionen relativ konservativ gehalten. Daher haben wir den Glycinatester auf MOG durch i) sperrigere Alkylester wie Ethyl oder Isopropyl (Verbindungen 2–3), ii) Ester mit Methylsubstituenten in der α-Position (Verbindungen 4–6), iii) ein Keton (Verbindung) ersetzt 7) oder iv) 5-gliedrige aromatische Heterocyclen (Verbindungen 8–10). Wichtig ist, dass die Verbindungen 1–6 voraussichtlich entestert werden, um NOG oder methylsubstituiertes NOG zu bilden, und daher wahrscheinlich auch intrazelluläre Ziele angreifen können.

Die Ester 2 und 3 wurden entwickelt, um die sterische Hinderung des Estersubstituenten minimal zu erhöhen, was voraussichtlich sowohl die chemische als auch die enzymvermittelte Instabilität verringert29,30,31,32,33. Wir haben auch verzweigte Ester (4–6) untersucht, da Substitutionen am α-Kohlenstoff die chemische Stabilität erhöhen können34 und zelluläre Esterasen eine überraschende Selektivität gegenüber komplexen Estern zeigen können35,36,37. Ketone (7) und Amide sind klassische Esterisostere38, wobei das Amid typischerweise zur Verbesserung der Stabilität von Arzneimitteln verwendet wird39. Bemerkenswert ist, dass solche kleinen Änderungen erhebliche Auswirkungen auf die Bindungsaffinität der Verbindungen an ihre Ziele haben können40. Schließlich wurden auch 5-Ring-Heterocyclen wie Oxadiazole (10) oder Oxazole (8) erfolgreich als Ester-Bioisostere eingesetzt41,42,43,44.

Um die MCT2-Abhängigkeit der Aufnahme von MOG-Analoga in Zellen zu bestimmen, verwendeten wir HCC1569-Zellen, eine menschliche Brustkrebslinie, die sehr geringe Mengen an MCT2 exprimiert und von Natur aus resistent gegen MOG-induzierte Toxizität ist18. Wir verglichen die Verbindungsaufnahme in diesen Zellen, die mit einem Kontrollplasmid mit leerem Vektor (HCC1569-EV) transduziert wurden, mit einer isogenen Linie, die exogenes menschliches MCT2 (HCC1569-MCT2) exprimiert (Abb. 2a, b). Nach 4-stündiger Inkubation beider Zelllinien mit jedem Analogon testeten wir, ob Verbindungen oder Derivate davon intrazellulär nachgewiesen werden konnten. Im Fall der Verbindungen 7–10 konnten wir die intakte Ausgangsverbindung nachweisen, jedoch wurden erwartungsgemäß alle Verbindungen 1–6 intrazellulär entestert und daher haben wir in diesen Fällen NOG bzw. das gebildete methylsubstituierte NOG quantifiziert. Intakte MOG-Analoga oder ihre Produkte sammelten sich in unterschiedlichem Ausmaß intrazellulär an, wobei diejenigen, die von den sperrigeren Alkylestern (2 und 3) und α-Methylsubstituenten (4–6) abgeleitet waren, Konzentrationen im millimolaren Bereich erreichten (Abb. 2c). Es wird erwartet, dass die Entesterung der Verbindungen 1–6 innerhalb der Zellen ihre Membranpermeabilität weiter verringert, was sie effektiv in den Zellen einschließen könnte und die beobachteten höheren Konzentrationen erklären könnte. Wir definierten die MCT2-abhängige Aufnahme als einen zweifachen Anstieg der Verbindungsakkumulation in HCC1569-MCT2-Zellen im Vergleich zu HCC1569-EV-Zellen45. Die Abhängigkeit der Aufnahme von MCT2 variierte zwischen den Verbindungsgruppen, blieb jedoch bei beiden sperrigeren Alkylestern (wobei die Faltungsänderung bei der Aufnahme von Verbindung 2 mit der von MOG vergleichbar war) sowie bei allen drei 5-gliedrigen Alkylestern bestehen aromatische Heterocyclen (Verbindungen 8–10, Abb. 2d).

ein Schema zur Veranschaulichung des Zellsystems, das zur Beurteilung der Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von MOG-Analoga von MCT2 verwendet wird. Menschliche HCC1569-Brustkrebszellen wurden entweder mit einer leeren pBabePuro-Vektorkontrolle (EV) oder pBabePuro-MCT2 transduziert, um exogenes MCT2 stabil zu exprimieren. b Western-Blot, der die Expression von exogenem MCT2 in HCC1569-EV- oder HCC1569-MCT2-Zellen zeigt, die wie in (a) beschrieben erzeugt wurden. c Konzentration jedes der Analoga oder der angegebenen Verbindungen, die sie in Zellen produzieren, in HCC1569-EV- oder HCC1569-MCT2-Zellen, die 4 Stunden lang mit 1 mM jedes der angegebenen Analoga inkubiert wurden (n = 4 unabhängige Vertiefungen, Mittelwert ± SD) . d-Fachunterschied in der intrazellulären Konzentration jedes Analogons oder der angegebenen Verbindungen, die sie in Zellen produzieren, in HCC1569-MCT2-Zellen im Vergleich zu HCC1569-EV-Zellen. Es wurde davon ausgegangen, dass Analoga mit einem > 2-fachen Anstieg (gestrichelte Linie) MCT2-abhängig aufgenommen wurden (n = 4, Mittelwert ± SD). e Links: Schema (erstellt mit Biorender), das die Strategie zum Testen der Analoga 4–7 als mutmaßliche MCT2-Inhibitoren veranschaulicht. In mit MOG behandelten Zellen hemmt NOG Stoffwechselenzyme und führt dadurch zu einer verminderten Atmung. Mutmaßliche MCT2-Inhibitoren verhindern den Eintritt von MOG und sollen die MOG-induzierte Hemmung der Atmung abschwächen. Rechts: Mittlere ± SD-Änderung der Basalzellatmung (berechnet aus den im mittleren Feld gezeigten Daten) nach Behandlung von INS1-EV- oder INS1-MCT2-Zellen mit MOG in Gegenwart oder Abwesenheit der angegebenen MOG-Analoga. MOG hemmt die Atmung nicht, wenn keine exogene MCT2-Expression vorliegt, was die Spezifität des Tests verdeutlicht. AR-C155858 wurde als Positivkontrolle für die MCT2-Hemmung verwendet. Das Ketonanalogon 7 schwächt die MOG-induzierte Hemmung der Atmung ab, was darauf hindeutet, dass es sich bei dieser Verbindung um einen MCT2-Inhibitor handelt. Signifikanztest mit einer einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Test für mehrere Vergleiche (n = 2–5 unabhängige Messungen). f LC-MS-Analyse zur Beurteilung der Stabilität von MOG oder der sperrigeren Alkyl-MOG-Analoga 2 und 3 in Zellkulturmedien über die Zeit (n = 3 unabhängige Replikate).

Obwohl wir im Vergleich zu den Kontrollen einen leichten Anstieg der Aufnahme der α-Methyl- und Ketonanaloga in MCT2-exprimierenden Zellen feststellten, erfüllten diese Verbindungen nicht das zweifache Cut-Off-Kriterium. Da diese Verbindungen (4–7) nur sehr geringfügige Modifikationen des MOG-Gerüsts aufweisen, haben wir überlegt, ob sie möglicherweise hemmend mit MCT2 interagieren. Um diese Idee zu testen, untersuchten wir die Fähigkeit von 4–7, eine MOG-induzierte, MCT2-abhängige Hemmung der Atmung18 in INS1-Zellen (einer Ratten-Pankreas-β-Zelllinie mit geringer Expression aller endogenen MCT-Isoformen46) zu verhindern, die exogenes menschliches MCT2 exprimierten (INS1-MCT2) (Abb. 2e und Methoden). Bei der Behandlung mit MOG verringerte sich die Basalatmung der INS1-MCT2-Zellen (jedoch nicht der EV-Kontrollzellen) um 60 %. AR-C155858, ein zuvor beschriebener Inhibitor von MCT247, verhinderte die Hemmung der Atmung durch MOG fast vollständig. Die Zugabe der α-Methylsubstituenten hatte keinen Einfluss auf die MOG-induzierte Abnahme der Atmung, die gleichzeitige Inkubation mit Verbindung 7 verringerte jedoch die Hemmwirkung von MOG um die Hälfte. Wichtig ist, dass keines der Analoga allein die Atmung hemmte (Abb. 2e, mittleres Feld). Dieser Befund legt nahe, dass der Ersatz des Glycinatesters durch eine Ketongruppe MOG von einem Substrat in einen Inhibitor von MCT2 umwandelt.

Um zu testen, ob der Unterschied im [NOG]IC in mit den Analoga 2 und 3 behandelten Zellen auf eine veränderte Stabilität und damit die Verfügbarkeit der Verbindungen für Zellen zurückzuführen ist, haben wir die Umwandlung dieser Verbindungen in NOG in Zellkulturmedien gemessen. Beide Verbindungen zeigten eine ähnliche, verbesserte Stabilität im Vergleich zu MOG (Abb. 2f), was darauf hindeutet, dass ein erhöhter [NOG]IC in mit Verbindung 2 behandelten Zellen im Vergleich zu Verbindung 3 wahrscheinlich eher auf Unterschiede im Transport oder in den intrazellulären Entesterungsraten als auf Unterschiede in zurückzuführen ist ihre Stabilität in den Medien. Interessanterweise war die Halbwertszeit von Verbindung 3 im Blut deutlich länger als die von MOG oder Verbindung 2, was sich auch in der größeren Persistenz von 3 im Vergleich zu MOG im Blut von Tieren widerspiegelt, denen diese Verbindungen verabreicht wurden (ergänzende Abbildung 2b).

Zusammenfassend haben wir MOG-Analoga mit unterschiedlicher Abhängigkeit von MCT2 für den Zelleintritt und mit der Fähigkeit, eine Reihe von [NOG]IC zu erzeugen, generiert. Weitere Untersuchungen konzentrierten sich auf Verbindungen, die eine MCT2-abhängige Aufnahme zeigten.

MOG hemmt die Zellproliferation und führt in Abhängigkeit von [NOG]IC18 zur Apoptose in MCT2-exprimierenden Zellen. Wir haben daher untersucht, ob die sperrigeren Alkylester und 5-gliedrigen aromatischen Heterocyclen die Fähigkeit behalten, in unserem HCC1569 ± MCT2-Zellmodell Zytotoxizität hervorzurufen. Über 96 Stunden hemmte MOG die Ansammlung von Zellmasse in konzentrationsabhängiger Weise (Abb. 3a). Diese Hemmung war in MCT2-exprimierenden Zellen deutlich höher und ging mit einer erhöhten Apoptose einher. Im Gegensatz dazu lösten die sperrigeren Alkylester (2, 3), obwohl sie die Zellmassenakkumulation in HCC1569-MCT2-Zellen ebenfalls stärker verlangsamten als in HCC1569-EV-Zellen, außer bei der höchsten Konzentration keine nennenswerte Apoptose aus. Die zytostatischen Wirkungen der Analoga 2 und 3 in HCC1569-MCT2-Zellen waren proportional zum beobachteten [NOG]IC, der nach der Behandlung mit diesen Verbindungen erreicht wurde (Abb. 3b). Die 5-gliedrigen aromatischen Heterocyclen (8–10) hatten keinen Einfluss auf die Zellmassenakkumulation, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von MCT2, mit Ausnahme von Verbindung 9, die bei der höchsten Dosis zu einem geringen Anstieg der Apoptose führte.

a Konfluenz- und Apoptosemessungen über die Zeit von HCC1569-EV- oder HCC1569-MCT2-Zellen in Gegenwart von MOG-Analoga, die den Zellen in den angegebenen Konzentrationen nach 20 Stunden zugesetzt wurden (gestrichelte Linie) (n = 3 unabhängige Vertiefungen, Mittelwert ± SD). b Der Grad der Hemmung der Zellmassenakkumulation nach Behandlung mit 1 mM der angegebenen Analoga (Daten aus Panel a) ist proportional zum entsprechenden [NOG]IC, der durch jedes Analogon hervorgerufen wird. Fehlerbalken repräsentieren ± SD. c Konfluenz von MCF7-, SN12C- oder LN229-Zellen über die Zeit in Gegenwart der angegebenen Verbindungen, die den Zellen nach 16 Stunden zugesetzt wurden (n = 3 unabhängige Vertiefungen, Mittelwert ± SD). d [NOG]IC in MCF7-, SN12C- oder LN229-Zellen, die 4 Stunden lang mit jeweils 1 mM der angegebenen Substanzen behandelt wurden (n = 4 unabhängige Vertiefungen, Mittelwert ± SD).

Wir haben auch die zelluläre Wirkung und die Aufnahme unserer Analoga in LN229- (Glioblastom), MCF7- (Brustkrebs) und SN12C- (Nierenkrebs) Zellen getestet, die endogenes MCT218 exprimieren. MOG schwächte die Ansammlung von Zellmasse in allen drei Zelllinien ab (Abb. 3c). Die Verbindungen 2 und 3 verursachten entweder eine geringe oder keine Abnahme der Zellmassenakkumulation und führten zu einem viel niedrigeren [NOG]ic im Vergleich zu dem, der mit MOG erreicht wurde (Abb. 3d). Bemerkenswert ist, dass 2 und 3 in diesen Zellen [NOG]ic hervorriefen, das fast zehnmal niedriger war als das in HCC1569-MCT2-Zellen hervorgerufene [NOG]ic (Abb. 3b), was wahrscheinlich die abgeschwächte zytostatische Wirkung dieser Verbindungen in Zellen mit erklärt endogene MCT2-Expressionsniveaus im Vergleich zu MCT2-überexprimierenden Zellen.

Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass durch die Substitution des Methylesters von MOG durch sperrigere Alkylester Verbindungen entstehen, die unter gleichwertigen Behandlungsbedingungen niedrigere intrazelluläre NOG-Werte und eine geringere oder keine Zytotoxizität im Vergleich zu MOG ergeben.

Die MCT2-Expression fördert die MOG-induzierte Zytotoxizität, indem sie metabolische Veränderungen aufgrund hoher [NOG]ic18 hervorruft. Wir stellten die Hypothese auf, dass das Fehlen zytotoxischer Wirkungen durch MCT2-abhängige MOG-Analoga (2, 3, 8–10) mit einer verminderten Fähigkeit, den Stoffwechsel zu stören, zusammenhängt. Um diese Idee zu testen, behandelten wir Zellen 4 Stunden lang mit MOG-Analoga und analysierten ihren Stoffwechsel mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Wie bereits beschrieben18 verursachte MOG eine charakteristische MCT2-abhängige Abnahme der TCA-Zyklus-Zwischenprodukte und einen Anstieg der Aminosäurekonzentrationen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 3a, b). In Übereinstimmung mit unserer Hypothese war diese Stoffwechselsignatur in Zellen, die mit einem der getesteten Analoga behandelt wurden, deutlich gedämpft (ergänzende Abbildung 3a, b). In ähnlicher Weise zeigten Zellen mit endogenen MCT2-Spiegeln (MCF7, SN12C und LN229) im Vergleich zu MOG eine abgeschwächte Stoffwechselreaktion auf die Analoga 2 und 3 (Abb. 4a).

eine Wärmekarte, die log2-fache Änderungen in der mittleren Häufigkeit der angegebenen Metaboliten in MCF7-, LN229- und SN12C-Zellen zeigt, die 4 Stunden lang mit den angegebenen Verbindungen behandelt wurden, im Vergleich zu mit DMSO (Vehikel) behandelten Kontrollen. Die Metaboliten sind im mit MCF7 MOG behandelten Zustand vom höchsten zum niedrigsten Fold-Change-Wert geordnet. B. Schema zur Veranschaulichung verschiedener Wege der Citratsynthese und anschließender Markierungsmuster von [U-13C]-Glutamin. c Markierung von Citrat aus [U-13C]-Glutamin in MCF7-, LN229- oder SN12C-Zellen, die 4 Stunden lang mit 1 mM jedes der angegebenen Analoga behandelt wurden. n = 4 unabhängige Vertiefungen, Mittelwert ± SD; Signifikanztest durch mehrere t-Tests mit Holm-Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). d Western-Blot, der die HIF1α-Proteinexpression in HCC1569-EV- oder HCC1569-MCT2-Zellen zeigt, die 4 Stunden lang mit 0,1 oder 1,0 mM der angegebenen Analoga oder mit DMSO behandelt wurden. e Western-Blot, der die Proteinspiegel von HIF1α, den HIF1α-Zielgenproteinprodukten LDHA und PKM2 und dem mTORC1-Kinase-Substrat S6K (gesamt und an Thr389 phosphoryliert) in Lysaten von MCF7-Zellen zeigt, die 4, 8 oder 10 Tage lang mit 1 mM der angegebenen Verbindungen behandelt wurden 24 Std.

Durch hohe [NOG]IC induzierte Stoffwechselveränderungen werden teilweise durch die Hemmung von GDH und IDH vorangetrieben. In mit [U13C]-Glutamin markierten Zellen kann das Ausmaß der GDH- oder IDH-Hemmung durch Überwachung der Konzentrationen des Citrat-m ​​+ 4-Isotopologen, der durch die oxidative Verwendung von Glutaminkohlenstoffen im kanonischen TCA-Zyklus gebildet wird, bzw. des Citrat-m ​​bestimmt werden + 5-Isotopologe, hergestellt durch reduktive Carboxylierung von αKG (Abb. 4b)18.

Die Behandlung von Zellen mit 2 oder 3 hatte keinen Einfluss auf die Citrat-m+4-Markierung und verursachte eine leichte MCT2-abhängige Abnahme von Citrat-m+5, die jedoch deutlich weniger ausgeprägt war als die durch MOG verursachte (ergänzende Abbildung 3c). Die Analoga zeigten ähnlich abgeschwächte Wirkungen auf die von [U13C]-Glutamin abgeleitete Citratmarkierung in SN12C-, MCF7- und LN229-Zellen (Abb. 4c). Bemerkenswerterweise war die leichte Abnahme von Citrat m + 5 bei 2 ausgeprägter als bei 3, was den höheren [NOG]IC in den mit ersterem behandelten Zellen widerspiegelt (Abb. 3d).

Zusammengenommen stützen diese Stoffwechselanalysen die Idee, dass ein niedrigerer [NOG]IC, der durch sperrigere Alkyl-MOG-Analoga hervorgerufen wird, nicht ausreicht, um den Glutaminstoffwechsel vollständig zu hemmen, und erklären zusammen mit früheren Beobachtungen18 deren verminderte Fähigkeit, Zytotoxizität auszulösen.

DMOG hemmt PHDs und fördert dadurch die Stabilisierung von HIF1α bei niedrigerem [NOG]IC als zur Hemmung der Glutaminolyse erforderlich, da NOG eine höhere Affinität für PHDs als für Stoffwechselziele hat18. Um zu testen, ob der niedrige [NOG]IC, den wir bei MOG-Analoga gefunden haben, ausreicht, um HIF1α zu stabilisieren, haben wir Zellen 4 Stunden lang mit jedem Analogon bei 1 mM behandelt (eine typische Konzentration, bei der DMOG zur Stabilisierung von HIF1α in Zellkulturstudien verwendet wird) und überwacht HIF1α-Spiegel durch Western Blot. In HCC-1569 ± MCT2-Zellen induzierte jeder der Alkylester (2, 3), die intrazellulär NOG produzieren, eine HIF1α-Stabilisierung (Abb. 4d) in MCT2- und [NOG]IC-abhängiger Weise. Umgekehrt induzierten die aromatischen Heterocyclen (8–10) keine HIF1α-Stabilisierung, was darauf hindeutet, dass trotz der Erhaltung der Oxoacetat-Einheit von NOG die Hinzufügung einer aromatischen Gruppe an der Glycinatstelle bei den von uns verwendeten Verbindungskonzentrationen nicht mit der Hemmung von PHDs vereinbar ist . In MCF7-Zellen stabilisierten die Verbindungen 2 oder 3 HIF1α mit einer ähnlichen Kinetik wie MOG (Abb. 4e). Wichtig ist, dass die Proteinspiegel von Laktatdehydrogenase A (LDHA) und Pyruvatkinase M2 (PKM2), zwei prototypischen HIF1α-Genzielen, als Reaktion auf die Behandlung mit den Verbindungen 2 und 3 und mit vergleichbarer Kinetik gleichermaßen hochreguliert wurden. Diese Daten zeigten, dass die Analoga 2 und 3 zwar zu einem niedrigeren [NOG]IC als MOG führen, HIF1α jedoch im gleichen Ausmaß wie MOG in Zellen mit endogener Expression von MCT2 stabilisieren.

Zusätzlich zur Regulierung von HIF1α wurde berichtet, dass PHDs auch die Glutaminolyse-induzierte mTORC1-Aktivierung vermitteln. Da MOG-Analoga die Glutaminolyse nicht hemmen, aber dennoch PHDs hemmen können, haben wir ihre Auswirkungen auf die Phosphorylierung der ribosomalen Protein-S6-Kinase (S6K) (ein typisches Maß für die mTORC1-Aktivität) mit denen von MOG verglichen, das sowohl Glutaminolyse als auch PHDs hemmen kann. Obwohl 2 und 3 PHDs hemmen konnten (wie durch HIF1α-Stabilisierung gezeigt), konnten sie die mTORC1-Signalübertragung nach 4 oder 8 Stunden Behandlung nicht hemmen (Abb. 4e). Alle drei Verbindungen unterdrückten die S6K-Phosphorylierung nach 24 Stunden, was darauf hindeutet, dass diese latente mTORC1-Hemmung wahrscheinlich eher eine Folge der HIF1α-Aktivierung ist als eine direkte Wirkung der Analoga. Daher ergab ein Vergleich der Wirkungen von Analoga zu MOG, dass die hemmenden Wirkungen von (D)MOG auf die mTORC1-Signalübertragung wahrscheinlich eher auf eine abgeschwächte Glutaminolyse als auf eine Hemmung von PHDs zurückzuführen sind. In Übereinstimmung mit dieser Idee konnte der spezifischere PHD-Inhibitor FG4592 die mTORC1-Aktivierung nicht unterdrücken, nachdem ausgehungerte Zellen erneut mit Aminosäuren (einem prototypischen mTORC1-Aktivator) gefüttert wurden (ergänzende Abbildung 3d).

Zusammenfassend zeigten unsere Daten, dass die Verbindungen 2 und 3 zur Hemmung von PHDs führten, jedoch im Vergleich zu MOG nur minimale metabolische Effekte, Zytotoxizität und mTORC1-Hemmung verursachten, was es uns ermöglichte, die durch seine metabolischen Ziele hervorgerufenen zellulären Effekte von NOG von denen zu entkoppeln, die aufgrund auftreten zu Doktoranden.

Der Stoffwechsel hat weitreichende Auswirkungen auf die Zellphysiologie, die über die Ansammlung von Biomasse, die Energieproduktion und das Redoxgleichgewicht hinausgehen. Ein prototypisches Beispiel für dieses Konzept ist α-KG, ein zentraler Stoffwechselknoten, der nicht nur der Eintrittspunkt von Glutamin-abgeleiteten Kohlenstoffen in den TCA-Zyklus ist, sondern auch wichtige regulatorische Rollen für wichtige Signalproteine ​​wie mTOR und HIF1α8,15 spielt. Darüber hinaus fungiert αKG als Cofaktor für DNA- und Chromatin-modifizierende Enzyme wie TET-Hydroxylasen9 und Jumonji-Demethylasen7; Folglich können Schwankungen der αKG-Konzentration auch epigenetische Prozesse beeinflussen und zu lang anhaltenden Auswirkungen innerhalb der Zelle führen. NOG ist ein strukturelles Analogon von αKG, das zum Verständnis vieler etablierter Rollen dieses wichtigen Metaboliten verwendet wurde. DMOG ist ein membrandurchlässiger NOG-Ester, der in Zellkulturmedien schnell zum Monocarboxylat MOG, einem Substrat des Transporters MCT2, entestert wird. Das Expressionsniveau von MCT2 bestimmt den [NOG]IC, der in hohen Konzentrationen eine Reihe von Stoffwechselzielen mit geringer Affinität wie GDH und IDH hemmt, was zu Toxizität in MCT2-exprimierenden Krebszellen führt18.

Zusätzlich zu seiner In-vitro-Verwendung wurde DMOG in großem Umfang verwendet, vor allem als pharmakologischer Stabilisator von HIF1α, in vivo für präklinische Studien49,50, wobei es typischerweise in Konzentrationen verabreicht wird, die weit über den zur Hemmung des beabsichtigten intrazellulären Effekts erforderlichen Konzentrationen liegen Ziele11,51,52. Die DMOG-Instabilität als Folge der chemischen oder enzymatischen Entesterung und ein anschließender Verlust der Zellpermeabilität könnten die Unterschiede in der Wirksamkeit erklären, die zwischen In-vitro-Studien (gereinigtes Enzym) und In-vivo-Studien beobachtet wurden, insbesondere angesichts der hohen Esteraseaktivität in Blut. Zur Untermauerung dieser Hypothese zeigen wir hier, dass sowohl DMOG als auch MOG im Blut schnell in NOG umgewandelt werden, jeweils mit einer Halbwertszeit von weniger als 5 Minuten. Diese schlechte Stabilität im Blut sollte daher ein zentraler Gesichtspunkt bei der Verwendung von DMOG als Werkzeugverbindung in vivo sein.

MCT2 hat eine Reihe etablierter physiologischer und pathologischer Rollen, ist jedoch eines der weniger untersuchten Mitglieder der Familie der Monocarboxylattransporter. Ein detaillierteres mechanistisches Verständnis dieses Transporters könnte daher neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen und die Grundlage für weitere Studien zur Entwicklung von In-vivo-Bildgebungsinstrumenten bilden. Die neuen MOG-Analoga, über die wir hier berichten, haben uns geholfen, die Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) zwischen MCT2 und seinen Liganden weiter zu erforschen, über das hinaus, was auf der Grundlage endogener Substrate festgestellt wurde19.

Interessanterweise beobachteten wir eine sehr geringe Toleranz für die α-Methyl-Substitutionen (4–6), die alle unseren zweifachen Schwellenwert für die MCT2-abhängige Aufnahme nicht erreichten. Diese drei Analoga weisen eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit mit α-Ketoisocaproat auf (Abb. 1d, ergänzende Abb. 1a), für das MCT2 einen Km von 100 µM aufweist19. Ihr fehlender Transport lässt daher darauf schließen, dass die Kombination einer α-Methylsubstitution mit einer Carboxylestergruppe nicht von MCT2 aufgenommen werden kann (Abb. 2c, d). Obwohl wir auch keinen MCT2-abhängigen Transport des Ketonanalogs (7) beobachteten, verhinderte diese Verbindung überraschenderweise eine MOG-induzierte Abnahme der Zellatmung, was darauf hindeutet, dass sie die MCT2-Transportaktivität hemmen kann (Abb. 2e). Dieser Befund könnte möglicherweise darauf hindeuten, dass 7 zwar immer noch an MCT2 binden kann, der Sauerstoff im MOG-Ester jedoch an einer Wechselwirkung innerhalb der Substratbindungstasche beteiligt ist, die für den Transport erforderlich ist.

Der MCT2-abhängige Transport wurde in den sperrigeren Alkylestern aufrechterhalten. Wir fanden heraus, dass der Ersatz der Methylester-Abgangsgruppe durch einen Ethylester (2) von MCT2 gut toleriert wurde, wobei die Aufnahme durch MCT2-exprimierende Zellen im Vergleich zur Kontrollzelllinie fast achtfach höher war. Der MCT2-abhängige Transport wurde mit einer Isopropylester-Substitution (3) aufrechterhalten, war jedoch im Vergleich zu 2 geringer, was darauf hindeutet, dass die erhöhte Größe der Substitution zu einer gewissen sterischen Hinderung innerhalb des Transporters führte.

Die 5-gliedrigen aromatischen Heterocyclen (8–10) wurden ebenfalls alle in MCT2-abhängiger Weise mit einer zwei- bis vierfachen Anreicherung in MCT2-exprimierenden Zellen transportiert. Angesichts des zunehmenden Interesses an der Rolle von MCT2 bei Krebs22,23,24 stellt dieser Befund einen nützlichen Satz von Gerüsten für die Entwicklung von Liganden zur Abbildung der MCT2-Aktivität in vivo dar.

Selbst bei sehr selektiven Medikamenten können intrazelluläre Konzentrationen, die höher sind als die, die zum Angriff auf das beabsichtigte Ziel erforderlich sind, zu Effekten außerhalb des Ziels und zu Toxizität führen. Hier zeigen wir, dass die durch Transporter vermittelte Aufnahme die intrazelluläre Konzentration von Verbindungen bestimmt und dadurch deren Wirksamkeit und Toxizität bestimmt. Obwohl beide sperrigeren Alkylester (2, 3) intrazellulär in NOG umgewandelt werden, schwankte der in MCT2-exprimierenden Zellen erzielte [NOG]IC trotz jedes Analogons stark (48,1, 16,4 bzw. 4,65 mM für MOG, 2 und 3). in gleicher Konzentration dosiert werden. Der von jeder Verbindung erreichte [NOG]IC bestimmte ihre Wirkung innerhalb der Zellen, was sich in ihrem relativen Einfluss auf die Zellmassenakkumulation und Apoptose widerspiegelte (Abb. 3a, b). Das PHD-Engagement von 2 und 3 wurde über eine Reihe von Zelllinien mit sowohl überexprimierten als auch endogenen MCT2-Spiegeln aufrechterhalten, basierend auf der beobachteten Stabilisierung von HIF1α (Abb. 4d, e). In ähnlicher Weise inhibierten die Verbindungen 2 und 3 die reduktive Carboxylierung nur teilweise und unterdrückten die oxidative Produktion von Citrat (Abb. 4c, ergänzende Abb. 3c) durch Hemmung von GDH18 nicht signifikant; Daher führten diese Analoga nur zu einer minimalen Abreicherung der TCA-Zwischenprodukte im Vergleich zu der Abreicherung, die bei der Dosierung mit MOG beobachtet wurde (Abb. 4a, ergänzende Abb. 3a). Zusammengenommen deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass die fehlende Zytotoxizität in mit 2 und 3 behandelten Zellen darauf zurückzuführen ist, dass diese Verbindungen zu einem [NOG]IC führen, der nicht ausreicht, um alle NOG-Ziele anzugreifen, die insgesamt für die mit MOG beobachteten zellulären Wirkungen erforderlich sind.

Angesichts der umfassenden Rolle von αKG in Zellen wird allgemein davon ausgegangen, dass NOG als αKG-Nachahmer eine promiskuitive Verbindung ist. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Werkzeugverbindungen und potenzielle klinische Hinweise zu entwickeln, um eine Reihe seiner Ziele, insbesondere die Prolylhydroxylasen11, selektiver zu hemmen. Der unterschiedliche Transport unserer Analoga und die daraus resultierenden Unterschiede bei [NOG]IC haben es uns ermöglicht, den Wirkungsmechanismus von (D)MOG besser zu verstehen. Frühere Studien haben PHDs mit der Regulierung des mTORC1-Signalwegs in Verbindung gebracht, unter anderem durch den Nachweis, dass DMOG die mTORC1-Aktivität hemmt48. Da jedoch bekannt ist, dass Glutaminolyse auch mTORC115 aktiviert, erschweren die gleichzeitigen Wirkungen von (D)MOG sowohl auf die Glutaminolyse als auch auf die PHD-Aktivität diese Schlussfolgerungen. Wir zeigen hier, dass die Behandlung von Zellen mit MOG zwar zu einer schnellen Hemmung der mTORC1-Signalübertragung führt, die Verbindungen 2 und 3, die die PHD-Aktivität hemmen, aber die metabolischen Wirkungen von MOG nicht rekapitulieren, nicht in der Lage sind, die mTORC1-Signalübertragung zu hemmen. Insbesondere im Muskel wurde gezeigt, dass PHD1 mTORC1 unabhängig von seiner enzymatischen Aktivität reguliert53. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass PHDs mTORC1 in anderen physiologischen Kontexten regulieren. Unsere Ergebnisse legen jedoch nahe, dass unter den von uns verwendeten experimentellen Bedingungen die Hemmung der enzymatischen Aktivität von PHD allein nicht ausreicht, um die mTORC1-Aktivität zu beeinflussen.

Für αKG-abhängige Dioxygenasen jenseits von PHDs stehen weitaus weniger spezifische chemische Inhibitoren zur Verfügung. Die TET-Enzyme sind von besonderem Interesse, da sie nachweislich eine Rolle bei der Regulierung der DNA-Methylierung während der frühen Embryonalentwicklung spielen. In jüngerer Zeit wurde deutlich, dass diese Enzyme auch die Auswirkungen des zellulären Stoffwechselzustands auf die epigenetische Regulation54,55 vermitteln, was wiederum die Differenzierung bei Krebs beeinflussen kann16. Isoform-spezifische TET-Inhibitoren müssen noch entwickelt werden, daher wurden „Bump-and-Hole“-Ansätze56 eingesetzt, um das Targeting individueller Isoformen über manipulierte Enzymisoformen mit erweiterten aktiven Zentren zu ermöglichen, die sperrigere NOG-Analoga aufnehmen können57. Wir spekulieren, dass unsere Arbeit zur Schaffung zellpermeabler Derivate dieser NOG-Analoga beitragen könnte, was die Untersuchung spezifischer TET-Enzyme sowohl in Zellen als auch möglicherweise auch in vivo ermöglichen könnte.

Um schließlich die Untersuchung MCT2-spezifischer Wechselwirkungen zu ermöglichen, wurden unsere Analoga so konzipiert, dass sie MOG nachahmen. Unsere Erkenntnisse könnten jedoch auch allgemeiner für die vielen Labore von Nutzen sein, die DMOG als Werkzeug verwenden. Die weitere Entwicklung von Verbindung 3 mit Analoga, die auch über sperrigere Oxoacetat-Carboxylester-Gruppen verfügen, wird wahrscheinlich die Blutstabilität verbessern und gleichzeitig die allgemeine Membranpermeabilität aufrechterhalten, wodurch das pharmakokinetische Profil dieser Werkzeugverbindung weiter verbessert wird.

Weitere Informationen finden Sie unter „Ergänzende Methoden“.

HCC1569-, MCF7-, LN229- und SN12C-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Gibco, 31840), das 10 % fötales Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin enthielt, kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Alle Zelllinien wurden auf Mykoplasmenfreiheit getestet und die Identität wurde durch Short-Tandem-Repeat-Profiling (Francis Crick Institute Cell Services Science Technology Platform) bestätigt. Die Erzeugung von HCC1569-MCT2-überexprimierenden Zellen wurde durch retrovirale Transduktion von HCC1569-Zellen mit einem pBabe-puro-Vektor erreicht, der die SLC16A7-cDNA-Sequenz enthielt, wie zuvor beschrieben18. Als Kontrollen wurden HCC1569-EV-Zellen verwendet, die mit einem leeren pBabe-puro-Vektor transduziert wurden.

Zellen auf Zellkulturschalen wurden zweimal mit PBS gewaschen, bevor sie in SDS-Probenpuffer (ohne Beta-Mercaptoethanol oder Bromphenolblau) abgekratzt und 5 Minuten lang bei 95 °C gekocht wurden. Das Protein wurde mithilfe eines BCA-Assays quantifiziert, bevor Beta-Mercaptoethanol und Bromphenolblau hinzugefügt und durch SDS-PAGE aufgelöst wurden. Die Proteine ​​wurden durch Elektroblotting auf Nitrozellulosemembranen übertragen, bevor sie mit 5 % Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 150 mM NaCl) mit 0,05 % Tween 20 (TBS-T) blockiert wurden. Die Membranen wurden dann mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert, mit TBS-T gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Sekundärantikörper 1 Stunde lang bei RT in 5 % Milch-TBS-T inkubiert. Antikörper wurden durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht und mit einem Amersham Imagequant 600 RGB abgebildet.

Die verwendeten Primärantikörper wurden von Cell Signaling Technology erhalten: P-S6-Kinase #9234 1:1000, S6-Kinase #2708 1:2000, LDHA: #2012 1:1000, PKM2 #3198 1:1000; Sigma: β-Actin A5316 1:1000; BD Biosciences: HIF1α #610959 1:250; MCT2 1:500 (erstellt vom Anastasiou-Labor). Sekundärantikörper waren Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG von Millipore (#AP132P bzw. #AP127P).

Unbeschnittene Versionen aller in dieser Studie verwendeten Western Blots finden Sie in der ergänzenden Abbildung 4.

Zellproliferation und Apoptose wurden in Echtzeit mit einem IncuCyteZoom (Essen Bioscience) gemessen. Zelllinien wurden in 96-Well-Platten mit zwischen 4.000 und 9.000 Zellen pro Well (abhängig von der Wachstumsrate) in Gegenwart von Incucyte Caspase 3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (Essen Bioscience, verwendet gemäß den Anweisungen des Herstellers) ausgesät. MOG-Analoga wurden in den angegebenen Dosen 16–20 Stunden nach der Aussaat hinzugefügt. Der IncuCyteZoom wurde so programmiert, dass er Zellen (Phase und Fluoreszenz) in 3-Stunden-Intervallen abbildet, und eine automatisierte Bildanalyse wurde verwendet, um die Konfluenz und Anzahl der apoptotischen Zellen zu bestimmen.

Der Sauerstoffverbrauch wurde in intakten INS1-Zellen, die humanes MCT2 oder eine leere Vektorkontrolle stabil exprimierten, unter Verwendung eines Oroboros Oxygraph-2K-Sauerstoffelektrodensystems (Oroboros Instruments) bei 37 °C gemessen. Pro Replikat und Bedingung wurden Zellen aus einer konfluenten 10-cm-Zellkulturschale verwendet. Nach der Trypsinisierung wurden die Zellen in gepufferter Hank-Kochsalzlösung (HBSS) resuspendiert und vor Beginn der Oximetrie 30 Minuten lang mit 0,1 % DMSO oder 1 mM des angegebenen Analogons inkubiert. Unter jeder Behandlungsbedingung wurden nach einer ersten Messung des Grundsauerstoffverbrauchs 0,25 mM MOG zur Zellsuspension in der Oximeterkammer gegeben. Der Sauerstoffverbrauch wurde auf die Zellzahl normalisiert. Die Hemmung von MCT2 wurde durch die Fähigkeit von Analoga bestimmt, eine MOG-induzierte Abnahme der Zellatmung zu verhindern.

Die Zellen wurden einen Tag vor dem Experiment in 6-cm-Schalen in RPMI-Medium (wie oben beschrieben) ausgesät, das dialysiertes FCS (3.500 Da MWCO) enthielt. Das Medium wurde bei t = −1 h durch frisches ersetzt. Bei t = 0 wurde das Medium erneut durch Medium ersetzt, das [U-13C]-Glutamin (2 mM) und das MOG-Analogon von Interesse (1 mM) oder 0,1 % DMSO (Vehikelkontrolle) enthielt. Die Behandlung mit Verbindungen und die Markierung erfolgten 4 Stunden lang, sofern nicht anders angegeben. Pro Bedingung wurden vier oder fünf technisch nachgebildete Platten verwendet und zwei oder drei zusätzliche Platten jeder Zelllinie wurden gezählt, um sie zur Normalisierung der Metabolitenmessungen zu verwenden. Zur Berechnung des Zellvolumens wurde auch der Zelldurchmesser aufgezeichnet, um die intrazellulären Konzentrationen zu bestimmen. Zelldurchmesser und -zahl wurden mit einem Nexcelcom Bioscience Cellometer Auto T4 gemessen. Am Ende des Experiments wurden die Platten zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, bevor die Zellen durch Zugabe von 725 µl trockeneiskaltem Methanol gelöscht wurden. Anschließend wurde jede Platte auf Eis abgekratzt und die Proben in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 160 µl CHCl3 und 180 µl H2O (enthaltend 2 nmol Scyllo-Inositol als interner Standard) überführt. Die Platten wurden noch einmal mit weiteren 725 µl kaltem MeOH abgekratzt, das dann in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Rest der Probe gegeben wurde. Die Proben wurden 3 × 8 Minuten lang in einem Wasserbad beschallt und die Metaboliten über Nacht bei 4 °C extrahiert. Ausgefallenes Material wurde durch Zentrifugieren entfernt und die Proben wurden anschließend getrocknet und in 3:3:1 (Vol./Vol./Vol.) MeOH/H2O/CHCl3 (insgesamt 350 µl) resuspendiert, um polare und apolare Metaboliten in eine obere und untere wässrige Phase zu trennen organische Phase bzw.

Die Zellen wurden 4 Stunden lang mit MOG oder MOG-Analoga (1 mM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen und wie oben für GC-MS beschrieben extrahiert. Proben der polaren Phasen wurden 50-fach in 1:1 (Vol./Vol.) MeOH/H2O (enthaltend 5 µM [U-13C,15N]-Valin als interner Standard) verdünnt und mittels LC-MS wie unten beschrieben analysiert.

Für die GC-MS-Analyse wurden 150 µl der wässrigen Phase in einem Fläschcheneinsatz getrocknet, bevor sie zweimal mit 40 µl MeOH gewaschen und erneut getrocknet wurden. Die Proben wurden methoximiert (20 µl 20 mg/ml Methoxyamin in Pyridin, RT über Nacht), bevor sie ≥ 1 Stunde lang mit 20 µl N,O-Bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan (Sigma, 33148) derivatisiert wurden. Zur Durchführung der Metabolitenanalyse wurde ein Agilent 7890B-5977A GC-MS-System verwendet. Splitlose Injektion (Injektionstemperatur 270 °C) auf eine 30 m + 10 m × 0,25 mm DB-5MS + DG-Säule (Agilent J&W) wurde unter Verwendung von Helium-Trägergas im Elektronenstoßionisationsmodus (EI) verwendet. Die anfängliche Ofentemperatur betrug 70 °C (2 Minuten), mit anschließendem Anstieg auf 295 °C mit 12,5 °C/Minute und dann auf 320 °C mit 25 °C/Minute (vor 3 Minuten Halten). Die Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten wurde mithilfe der MassHunter Workstation-Software (B.06.00 SP01, Agilent Technologies) oder der MANIC-Software, einer eigens entwickelten Anpassung des GAVIN-Pakets58, durch Vergleich mit den Retentionszeiten, Massenspektren und Reaktionen bekannter Mengen authentischer Substanzen durchgeführt Standards. Die fraktionierte Kennzeichnung einzelner Metaboliten wird nach Korrektur der natürlichen Häufigkeit angegeben.

Die LC-MS-Methode wurde aus Lit. angepasst. 59. Die Proben wurden mithilfe einer ZIC-pHILIC-Säule (150 mm × 4,6 mm, 5 μm Partikel) (Merck Sequant) in ein Dionex UltiMate LC-System (Thermo Scientific) injiziert. Es wurde ein 15-minütiger Elutionsgradient verwendet (80 % Lösungsmittel A zu 20 % Lösungsmittel B), gefolgt von einer 5-minütigen Wäsche (95:5 Lösungsmittel A zu Lösungsmittel B) und einer 5-minütigen erneuten Äquilibrierung; Lösungsmittel A war 20 mM Ammoniumcarbonat in Wasser (Optima HPLC-Qualität, Sigma Aldrich) und Lösungsmittel B war Acetonitril (Optima HPLC-Qualität, Sigma Aldrich). Flussrate: 300 µl/min; Säulentemperatur: 25 °C; Injektionsvolumen: 10 µl; und Autosamplertemperatur 4 °C. MS wurde mit positiver/negativer Polaritätsumschaltung unter Verwendung eines Q Exactive Orbitrap (Thermo Scientific) mit einer HESI II-Sonde (beheizte Elektrospray-Ionisation) durchgeführt. MS-Parameter: Sprühspannung, 3,5 kV und 3,2 kV für positive bzw. negative Modi; Sondentemperatur 320 °C; Hüll- und Hilfsgase, 30 bzw. 5 beliebige Einheiten; voller Scanbereich, 70 bis 1.050 m/z mit den Einstellungen des AGC-Ziels und der Auflösung auf „ausgewogen“ und „hoch“ (3 × 106 bzw. 70.000). Zur Datenaufzeichnung wurde die Software Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific) verwendet. Vor der Analyse wurde eine Massenkalibrierung für beide ESI-Polaritäten unter Verwendung der Standardlösung Thermo Scientific Calmix durchgeführt. Die Kalibrierungsstabilität wurde durch die Anwendung einer Lock-Mass-Korrektur bei jedem Analyselauf unter Verwendung allgegenwärtiger Verunreinigungen mit geringer Masse verbessert. Erfassungsparameter für die parallele Reaktionsüberwachung: Auflösung 17.500; Ziel mit automatischer Verstärkungsregelung, 2 × 105; maximale Isolationszeit, 100 ms; Isolationsfenster, m/z 0,4; und Kollisionsenergien, individuell eingestellt im hochenergetischen Kollisions-Dissoziationsmodus. Gleiche Volumina jeder Probe wurden gepoolt, um Qualitätskontrollproben bereitzustellen, und während des Laufs analysiert, wodurch ein Maß für die Stabilität und Leistung des Systems bereitgestellt wurde. Zur Durchführung qualitativer bzw. quantitativer Analysen wurden gemäß den Arbeitsabläufen des Herstellers der Xcalibur Qual Browser und die Tracefinder 4.1-Software (Thermo Scientific) verwendet.

Blut wurde von eingeschläferten 10–12 Wochen alten weiblichen NSG-Mäusen in heparinisierten Röhrchen gesammelt und sofort für Experimente verwendet. Um die Stabilität zu testen, wurden die Verbindungen bei einer Endkonzentration von 100 µM in Blut (600 µL Gesamtvolumen) inkubiert und auf 37 °C vorgewärmt. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung bei 0 (Verbindung wurde der Probe nach der Extraktion hinzugefügt), 5, 15, 30 und 60 Minuten. Zum angegebenen Zeitpunkt wurden 30 µl entnommen und in ein Röhrchen auf Eis gegeben, das 100 µl Chloroform, 300 µl MeOH und 270 µl H2O enthielt. [U13C-15N]-Valin war in der wässrigen Phase in einer Endkonzentration von 5 µM vorhanden. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die Proben gevortext und auf Eis gelegt. Nachdem alle Proben gesammelt worden waren, wurden sie 3 × 8 Minuten lang beschallt und 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert, um die Extraktion fortzusetzen. Die Proben wurden dann zentrifugiert (10 Min., 4 °C, volle Geschwindigkeit) und die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführt und bei -80 °C gelagert, bis sie wie oben beschrieben für die Ausführung auf dem LC-MS-System (Q Exactive) bereit waren . Die Proben wurden anhand einer 7-Punkte-Standardkurve der Verbindung im Mausblutextrakt quantifiziert, um Matrixeffekte zu minimieren.

Alle experimentellen Verfahren mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des öffentlichen Gesundheitswesens zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und der GSK-Richtlinie für die Pflege, das Wohlergehen und die Behandlung von Tieren, genehmigt von der, durchgeführt Sie sind Mitglied des Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) des Francis Crick Institute und verfügen über eine vom britischen Innenministerium ratifizierte Lizenz für das Anastasiou-Labor. Erwachsene (10–12 Wochen alte) weibliche NSG-Mäuse erhielten durch intraperitoneale Injektion 1 (MOG) oder Verbindung 3 in einer Menge von 100 mg/kg. Vor der Injektion (t = 0) und 15 Minuten, 1 Stunde und 2 Stunden nach der Injektion wurden Blutproben aus der Vena saphena auf einem Mitra-Mikroprobenahmegerät (Kapazität 10 µl, 100601-A, Neoteryx) gesammelt. Am Ende des Experiments wurden die Tiere durch Zervixluxation eingeschläfert und die Gewebe sofort entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren, bevor sie bei -80 °C gelagert wurden. Für Blutproben wurde die „Schwamm“-Spitze des Mikroprobennehmers in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 33,3 µl CHCl3 und 100 µl MeOH überführt und gründlich gevortext. [U13C-15N]-Valin wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 µM in die wässrige Phase eingearbeitet. Die Proben wurden 3 × 8 Minuten lang bei 4 °C in einem Ultraschallwasserbad beschallt und bei -80 °C gelagert, bis sie benötigt wurden. Die Phasen wurden durch Zugabe von 90 µl H2O geteilt, bevor 5 Minuten lang bei 4 °C und voller Geschwindigkeit geschleudert wurde (da MOG-Analoga anfällig für wässrige Hydrolyse sind, wurde H2O unmittelbar vor dem Lauf zugegeben). Die wässrige Phase wurde wie oben beschrieben mit LC-MS durchgeführt.

Replikattyp und -nummern sind in jeder Abbildungslegende angegeben. Statistische Analysen während dieser Arbeit wurden mit GraphPad Prism® 7.0b oder späteren Versionen durchgeführt. Vergleiche wurden entweder mit ungepaarten T-Tests, mehreren T-Tests mit der Holm-Sidak-Methode für Mehrfachvergleichstests, einer einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Korrektur für Mehrfachvergleiche oder einer Zweifaktor-ANOVA mit Tukey-Test für Mehrfachvergleiche durchgeführt, wie in angegeben die jeweiligen Figurenlegenden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in der ergänzenden Abbildung 1b gezeigten Ergebnisse basieren auf Daten, die vom TCGA Research Network (https://www.cancer.gov/tcga) generiert wurden. Die Quelldaten, die den in dieser Studie gezeigten Diagrammen zugrunde liegen, sind in den Zusatzdaten 1 enthalten. Unbeschnittene Versionen der in dieser Studie verwendeten Western Blots (Abb. 2b, 4d, 4e und ergänzende Abb. 3d) finden Sie in der ergänzenden Abb. 4.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03922-8

Woolley, DW Die Revolution in der Pharmakologie. Perspektive. Biol. Med 1, 174–197 (1958).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Méndez-Lucas, A. et al. Identifizierung von Strategien zur gezielten Verbesserung der metabolischen Flexibilität von Tumoren. Nat. Metab. 2, 335–350 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. et al. Die Regulierung der Abhängigkeit vom Pentosephosphatweg und des Disulfidstresses durch den Cystintransporter legt eine gezielte metabolische Anfälligkeit bei Krebs offen. Nat Cell Biol 22, 476–486 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, H. et al. Eine rationale Kombination mit PDK1-Hemmung überwindet die Cetuximab-Resistenz bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich. Jci Insight 4, e131106 (2019).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Luengo, A., Gui, DY & Heiden, MGV Targeting des Stoffwechsels für die Krebstherapie. Zellchemie. Biol. 24, 1161–1180 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bobrovnikova-Marjon, E. & Hurov, JB Stoffwechselveränderungen bei Krebs gezielt angehen: neuartige Therapieansätze. Medizin 65, 157–170 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Hamada, S. et al. Synthese und Aktivität von N-Oxalylglycin und seinen Derivaten als Jumonji-C-Domänen enthaltende Histon-Lysin-Demethylase-Inhibitoren. Bioorg. Med. Chem. Lette. 19, 2852–2855 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jaakkola, P. et al. Ausrichtung von HIF-alpha auf den von Hippel-Lindau-Ubiquitylierungskomplex durch O2-regulierte Prolylhydroxylierung. Wissenschaft 292, 468–472 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Amouroux, R. et al. De-novo-DNA-Methylierung treibt die 5hmC-Akkumulation in Mauszygoten voran. Nat. Zellbiol. 18, ncb3296 (2016).

Artikel Google Scholar

Ivan, M. et al. HIFalpha zielt auf VHL-vermittelte Zerstörung durch Prolinhydroxylierung ab: Auswirkungen auf die O2-Erkennung. Wissenschaft 292, 464–468 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chan, MC, Holt-Martyn, JP, Schofield, CJ & Ratcliffe, PJ Pharmakologisches Targeting der HIF-Hydroxylasen – Ein neues Feld in der Arzneimittelentwicklung. Mol. Asp. Med 47–48, 54–75 (2016).

Artikel Google Scholar

Eltzschig, HK, Bratton, DL & Colgan, SP Zielgerichtete Hypoxie-Signalübertragung zur Behandlung ischämischer und entzündlicher Erkrankungen. Nat. Rev. Drogendisco. 13, 852–869 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Cummins, EP et al. Der Hydroxylase-Inhibitor Dimethyloxalylglycin wirkt in einem Mausmodell für Kolitis schützend. Gastroenterology 134, 156–165.e1 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Milkiewicz, M., Pugh, CW & Egginton, S. Die Hemmung der endogenen HIF-Inaktivierung induziert Angiogenese in ischämischen Skelettmuskeln von Mäusen. J. Physiol. 560, 21–26 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duran, RV et al. Glutaminolyse aktiviert die Rag-mTORC1-Signalübertragung. Mol. Zelle 47, 349–358 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morris, JP et al. α-Ketoglutarat verknüpft p53 mit dem Zellschicksal während der Tumorsuppression. Natur 573, 595–599 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shahmirzadi, AA et al. Alpha-Ketoglutarat, ein endogener Metabolit, verlängert die Lebensdauer und verringert die Morbidität bei alternden Mäusen. Zellmetabolismus 32, 447–456.e6 (2020).

Artikel Google Scholar

Fets, L. et al. MCT2 vermittelt eine konzentrationsabhängige Hemmung des Glutaminstoffwechsels durch MOG. Nat. Chem. Biol. 14, 1–18 (2018).

Artikel Google Scholar

BRÖER, S. et al. Charakterisierung des hochaffinen Monocarboxylattransporters MCT2 in Xenopus laevis-Oozyten. Biochem J. 341, 529 (1999).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pellerin, L., Halestrap, AP & Pierre, K. Zelluläre und subzelluläre Verteilung von Monocarboxylattransportern in kultivierten Gehirnzellen und im erwachsenen Gehirn. J Neurosci Res. 79, 55–64 (2004).

Artikel Google Scholar

Mächler, P. et al. In-vivo-Beweis für einen Laktatgradienten von Astrozyten zu Neuronen. Cell Metab 23, 94–102 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Pértega-Gomes, N. et al. Monocarboxylattransporter 2 (MCT2) als mutmaßlicher Biomarker bei Prostatakrebs. Prostata 73, 763–769 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Huang, C.-K. et al. Adipozyten fördern das bösartige Wachstum von Brusttumoren mit der Expression des Monocarboxylattransporters 2 über β-Hydroxybutyrat. Nat. Komm. 8, 1–13 (2017).

Google Scholar

Elia, I. et al. Brustkrebszellen sind auf Pyruvat aus der Umgebung angewiesen, um die metastatische Nische zu bilden. Natur 568, 1–5 (2019).

Artikel Google Scholar

Rautio, J. et al. Prodrugs: Design und klinische Anwendungen. Nat. Rev. Drogendisco. 7, 255–270 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Huttunen, KM, Raunio, H. & Rautio, J. Prodrugs – vom Zufall zum rationalen Design. Pharm. Rev. 63, 750–771 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zawilska, J.B., Wojcieszak, J. & Olejniczak, AB Prodrugs: eine Herausforderung für die Arzneimittelentwicklung. Pharm. Rep. 65, 1–14 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Jornada, D. et al. Der Prodrug-Ansatz: ein erfolgreiches Instrument zur Verbesserung der Arzneimittellöslichkeit. Molecules 21, 42 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoeckel, K. et al. Stabilität von Cephalosporin-Prodrug-Estern im menschlichen Darmsaft: Auswirkungen auf die orale Bioverfügbarkeit. Antimikrob. Agents Ch. 42, 2602–2606 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Barton, P., Laws, AP & Page, MI Struktur-Aktivitäts-Beziehungen bei der Esterase-katalysierten Hydrolyse und Umesterung von Estern und Lactonen. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 0, 2021–2029 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Talath, S., Shirote, P., Lough, W. & Gadad, A. Stabilitätsstudien einiger Glykolamidester-Prodrugs von Nifluminsäure in wässrigen Puffern und menschlichem Plasma durch HPLC mit UV-Detektion. Arzneimittelforschung 56, 631–639 (2011).

Artikel Google Scholar

JOHANSEN, M. & LARSEN, C. Ein Vergleich der chemischen Stabilität und der enzymatischen Hydrolyse einer Reihe aliphatischer und aromatischer Esterderivate von Metronidazol. Int J. Pharm. 26, 227–241 (1985).

Artikel CAS Google Scholar

Seki, H., Kawaguchi, T. & Higuchi, T. Spezifität von Esterasen und Struktur von Prodrug-Estern: Reaktivität verschiedener acylierter Paracetamolverbindungen und acetylaminobenzoierter Verbindungen. J. Pharm. Wissenschaft. 77, 855–860 (1988).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bender, DM et al. Cyclopropancarbonsäureester als potenzielle Prodrugs mit erhöhter Hydrolysestabilität. Org. Lette. 10, 509–511 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tian, ​​L. et al. Selektives Esterase-Ester-Paar zum Targeting kleiner Moleküle mit zellulärer Spezifität. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 109, 4756–4761 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lavis, LD Esterbindungen in Prodrugs. Acs Chem. Biol. 3, 203–206 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yamazaki, Y., Kageyama, Y. & Okuno, H. Direkte Bewertung der Stereoselektivität von Krebsesterasen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt mit Aktivitätsfärbung mit chiralen Naphthylestern. Anal. Biochem 231, 295–300 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Meanwell, NA Zusammenfassung einiger neuerer taktischer Anwendungen von Bioisosteren bei der Arzneimittelentwicklung. J. Med. Chem. 54, 2529–2591 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nassar, A.-EF, Kamel, AM & Clarimont, C. Verbesserung des Entscheidungsprozesses bei der strukturellen Modifikation von Arzneimittelkandidaten: Verbesserung der Stoffwechselstabilität. Drogendisco. Heute 9, 1020–1028 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Barlow, RB, Bremner, JB & Soh, KS Die Auswirkungen des Ersatzes von Estern durch Amide auf die biologischen Eigenschaften von Verbindungen, die mit Acetylcholin verwandt sind. Brit J. Pharm. 62, 39–50 (1978).

Artikel CAS Google Scholar

Patani, GA & LaVoie, EJ Bioisosterismus: ein rationaler Ansatz im Arzneimitteldesign. Chem. Rev. 96, 3147–3176 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Diana, GD et al. Oxadiazole als bioisosterische Esterersatzstoffe in mit Disoxaril verwandten Verbindungen. Antirhinovirus-Aktivität. J. Med. Chem. 37, 2421–2436 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Street, LJ et al. Synthese und biologische Aktivität von 1,2,4-Oxadiazol-Derivaten: hochwirksame und wirksame Agonisten für kortikale Muskarinrezeptoren. J. Med. Chem. 33, 2690–2697 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bach, P. et al. 5-Alkyl-1,3-oxazol-Derivate von 6-Amino-Nicotinsäuren als Alkylester-Bioisostere sind Antagonisten des P2Y12-Rezeptors. Future Med Chem. 5, 2037–2056 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brouwer, KLR et al. In-vitro-Methoden zur Unterstützung der Transporterbewertung bei der Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln. Klin. Pharm. Dort. 94, 95–112 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Sekine, N. et al. Niedrige Laktatdehydrogenase und hohe mitochondriale Glycerinphosphatdehydrogenase in Pankreas-Betazellen. Mögliche Rolle bei der Nährstofferkennung. J. Biol. Chem. 269, 4895–4902 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ovens, MJ, Davies, AJ, Wilson, MC, Murray, CM & Halestrap, AP AR-C155858 ist ein wirksamer Inhibitor der Monocarboxylattransporter MCT1 und MCT2, der an eine intrazelluläre Stelle bindet, an der die Transmembranhelices 7–10 beteiligt sind. Biochem J. 425, 523–530 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Durán, RV et al. HIF-unabhängige Rolle von Prolylhydroxylasen bei der zellulären Reaktion auf Aminosäuren. Oncogene 32, 4549–4556 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Kato, S., Takahashi, T., Miyata, N. & Roman, RJ DMOG, ein Prolylhydroxylase-Inhibitor, erhöht den Hämoglobinspiegel, ohne Bluthochdruck und Nierenschäden bei salzempfindlichen hypertensiven Ratten zu verschlimmern. J. Pharm. Exp. Dort. 372, 166–174 (2019).

Artikel Google Scholar

Dirscherl, K. et al. Die Hypoxieerkennung durch hepatische Sternzellen führt zu einer VEGF-abhängigen Angiogenese und kann zu einer beschleunigten Leberregeneration beitragen. Wissenschaft. Rep.-uk 10, 4392 (2020).

Artikel Google Scholar

Ogle, ME, Gu, Neurobiol. Dis. 45, 733–742 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagamine, Y. et al. Die Hemmung der Prolylhydroxylase schwächt die durch den Fas-Liganden induzierte Apoptose und Lungenschädigung bei Mäusen. Bin. J. bzw. Zellmol. 55, 878–888 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

D'Hulst, G. et al. PHD1 steuert Muskel-mTORC1 auf hydroxylierungsunabhängige Weise durch Stabilisierung der Leucyl-tRNA-Synthetase. Nat. Komm. 11, 174 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Carey, BW, Finley, LWS, Cross, JR, Allis, CD & Thompson, CB Intrazelluläres α-Ketoglutarat erhält die Pluripotenz embryonaler Stammzellen aufrecht. Natur 518, 413 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schvartzman, JM, Thompson, CB & Finley, LWS Stoffwechselregulation von Chromatinmodifikationen und Genexpression. J. Cell Biol. 217, jcb.201803061 (2018).

Artikel Google Scholar

Islam, K. Die Bump-and-Hole-Taktik: Erweiterung des Anwendungsbereichs der chemischen Genetik. Zellchemie. Biol. 25, 1171–1184 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sudhamalla, B. et al. Komplementäres sterisches Engineering an der Protein-Ligand-Grenzfläche für analogempfindliche TET-Oxygenasen. Marmelade. Chem. Soc. 140, 1–7 (2018).

Artikel Google Scholar

Behrends, V., Tredwell, GD & Bundy, JG Eine Software-Ergänzung zu AMDIS zur Verarbeitung von GC-MS-Metabolomdaten. Anal. Biochem 415, 206–208 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, T., Creek, DJ, Barrett, MP, Blackburn, G. & Watson, DG Bewertung der Kopplung von Umkehrphasen-, wässriger Normalphasen- und hydrophiler Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit Orbitrap-Massenspektrometrie für metabolomische Studien von menschlichem Urin. Anal. Chem. 84, 1994–2001 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Louise Fets

Aktuelle Adresse: Drug Transport and Tumor Metabolism Lab, MRC London Institute of Medical Sciences, London, Großbritannien

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Natalie Bevan, Patrícia M. Nunes.

Labor für Krebsstoffwechsel, Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Louise Fets, Natalie Bevan, Patrícia M. Nunes und Dimitrios Anastasiou

Crick–GSK Biomedical LinkLabs, London, Großbritannien

Sebastien Campos, Emma Sherriff und David House

Metabolomics Science Technology Platform, Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Mariana Silva dos Santos & James I. MacRae

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SC und DH entwarfen (mit Input von LF und DA) und synthetisierten MOG-Analoga und berieten beim experimentellen Design der Mausdosierung; NB half bei der Zelllinienarbeit und den damit verbundenen Western Blots und führte zusammen mit PN Zellatmungsexperimente durch; PN half auch bei der Wirkstoffdosierung bei Mäusen; ES unterstützte und beriet bei Messungen der Stabilität von Verbindungen; MSdS und JIM unterstützten und berieten bei Metabolomics-Experimenten; LF entwarf und führte alle anderen Experimente durch, analysierte und interpretierte die Daten. DA überwachte die Studie, entwarf Experimente und interpretierte Daten. LF schrieb den ersten Entwurf des Manuskripts und entwickelte ihn mit Unterstützung von DA und Input von SC und DH. Alle Autoren überprüften und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Dimitrios Anastasiou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Sonam Kumari, Shijie Cai und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Toril Holien und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fets, L., Bevan, N., Nunes, PM et al. MOG-Analoga zur Erforschung des MCT2-Pharmakophors, der α-Ketoglutarat-Biologie und der zellulären Wirkungen von N-Oxalylglycin. Commun Biol 5, 877 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03805-y

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Eingegangen: 3. März 2021

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 26. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03805-y

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