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Jun 23, 2023

Konformationsflexibilität bei der Neutralisierung von SARS

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 789 (2022) Diesen Artikel zitieren 23.000 Zugriffe 2 Zitate 775 Details zu altmetrischen Metriken Da weiterhin neue Varianten von SARS-CoV-2 auftauchen, ist dies wichtig

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 789 (2022) Diesen Artikel zitieren

23.000 Zugriffe

2 Zitate

775 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Da weiterhin neue Varianten von SARS-CoV-2 auftauchen, ist es wichtig, die kreuzneutralisierenden Fähigkeiten von Antikörpern zu bewerten, die auf natürliche Weise während einer Wildtyp-SARS-CoV-2-Infektion hervorgerufen werden. In der vorliegenden Studie bewerten wir die Aktivität von neun monoklonalen Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern (mAbs), die zuvor aus rekonvaleszenten Spendern isoliert wurden, die mit dem Wuhan-Hu-1-Stamm infiziert waren, gegen die besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten ( VOC) Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron. Durch das Testen einer Reihe von mutierten Spike-Rezeptor-Bindungsdomänen (RBD)-Proteinen, zellexprimierten Spike-Proteinen von VOCs und der Neutralisierung von SARS-CoV-2-VOCs als Pseudoviren oder als authentische Viren in Kultur zeigen wir, dass mAbs gegen die gerichtet sind Die ACE2-Bindungsstelle (ACE2bs) reagiert empfindlicher auf die Virusentwicklung als Anti-RBD-Nicht-ACE2bs-mAbs, von denen zwei ihre Wirksamkeit gegen alle getesteten VOCs behalten. Im zweiten Teil unserer Studie enthüllen wir die Neutralisierungsmechanismen zweier Anti-SARS-CoV-2-neutralisierender mAbs mit hoher molekularer Auflösung durch strukturelle Charakterisierung. Wir lösen die Strukturen des Delta-neutralisierenden ACE2bs-mAb TAU-2303 mit dem SARS-CoV-2-Spike-Trimer und RBD bei einer Auflösung von 4,5 Å bzw. 2,42 Å und offenbaren einen ähnlichen Bindungsmodus wie der zwischen RBD und ACE2. Darüber hinaus stellen wir fünf zusätzliche Strukturen (mit Auflösungen von 4,7 Å, 7,3 Å, 6,4 Å, 3,3 Å und 6,1 Å) eines zweiten Antikörpers, TAU-2212, bereit, der mit dem SARS-CoV-2-Spike-Trimer komplexiert ist. TAU-2212 bindet ein ausschließlich quartäres Epitop und weist einen einzigartigen, flexiblen Neutralisierungsmodus auf, der den Übergang zwischen fünf verschiedenen Konformationen beinhaltet, wobei beide Arme des Antikörpers für die Vernetzung von RBD-Untereinheiten innerhalb und zwischen Spikes rekrutiert werden. Unsere Studie liefert zusätzliche mechanistische Erkenntnisse darüber, wie Antikörper SARS-CoV-2 und seine neu auftretenden Varianten neutralisieren, und liefert Einblicke in die Wahrscheinlichkeit von Reinfektionen.

Innerhalb von zwei Jahren nach dem Auftreten des SARS-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in der Provinz Wuhan wurde der ursprüngliche Virusstamm vollständig durch übertragbarere Varianten ersetzt, wobei sich Omicron als neueste besorgniserregende Variante (VOC) herausstellte. Angesichts der unerwartet hohen Geschwindigkeiten der Virusentwicklung ist es wichtig abzuschätzen, inwieweit neutralisierende Antikörper, die auf natürliche Weise nach einer Infektion mit dem ursprünglichen Wildtyp-Stamm (Wuhan-Hu-1) hervorgerufen werden, mit zirkulierenden, gegenwärtigen und zukünftigen, kreuzreaktiven Antikörpern reagieren. VOCs. Dies ist besonders relevant angesichts aktueller Berichte, dass Impfungen deutlich weniger Schutz gegen SARS-CoV-2-Varianten bieten als gegen den ursprünglichen Stamm1,2,3.

Die SARS-CoV-2-Antikörperantwort wurde auf Sequenz-, Struktur- und mechanistischer Ebene durch Klonierung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAbs) von Wuhan-Hu-1-infizierten rekonvaleszenten Spendern profiliert4,5,6,7,8,9. Mit dem Aufkommen von Varianten sind jedoch viele dieser mAbs, von denen einige für die Behandlung von COVID-19-Patienten zugelassen sind10,11,12, unwirksam geworden13,14,15, während andere weiterhin aktiv sind16. Dies weist darauf hin, dass einige durch eine Infektion hervorgerufene Antikörper stärker auf Variationen reagieren als andere und dass die Breite der Antikörperspezifität und nicht nur die Wirksamkeit berücksichtigt werden sollte. Daher ist eine genauere Untersuchung der mechanistischen und funktionellen Grundlagen der Neutralisierung von SARS-CoV-2-Antikörpern erforderlich, um die Auswirkungen viraler Modifikationen auf die Antikörperaktivität vorherzusagen und den Grad des Schutzes vor einer erneuten SARS-CoV-2-Infektion und einer Durchbruchinfektion abzuschätzen . Darüber hinaus kann die Untersuchung der molekularen Erkennung natürlich erzeugter neutralisierender Antikörper im Zusammenhang mit heterologen Viren Stellen mit einer geringeren Variationstendenz aufdecken.

Wir haben zuvor eine Reihe neutralisierender SARS-CoV-2-Antikörper identifiziert, die von zwei COVID-19-Überlebenden stammen, die im März 2020 in Israel infiziert wurden, wahrscheinlich mit dem Wuhan-Hu-1-Stamm9. Sieben dieser mAbs (TAU-1109, -1145, -2189, -2212, -2230, -2303 und -2310) zeigten eine starke SARS-CoV-2-neutralisierende Aktivität, während die Aktivität von zwei weiteren (TAU-1115 und TAU -2220) war weniger wirksam. Alle mAbs bis auf einen binden die lösliche Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und spitzen sich mit hoher Affinität zu. Die Ausnahme ist TAU-2212, einer der wirksamsten neutralisierenden mAbs, der an eine unbekannte Konformationsoberfläche bindet und die Bindung nur dann nachgewiesen werden kann, wenn das Spike-Protein auf viralen Partikeln oder Zellen exprimiert wird. Obwohl sie neutralisierende Aktivität gegen den Stamm Wuhan-Hu-1 zeigen, ist die Kreuzreaktivität dieser mAbs mit VOCs von SARS-CoV-2 unbekannt.

Die vorliegende Studie sollte die Breite der Spezifität und strukturellen Basis der neutralisierenden Aktivität unserer zuvor isolierten mAbs im Kontext der neu auftretenden Varianten Alpha (B.1.1.7)17, Beta (B.1.351)18 und Gamma untersuchen (P.1 oder B.1.1.28.1)19, Delta (B.1.617.2)20,21 und Omicron (B.1.1.529)22. Die Ergebnisse zeigen, dass die wirksamsten mAbs in unserem Panel überwiegend gegen die Supersite der ACE2-Bindungsstelle (ACE2bs) gerichtet sind und auch diejenigen sind, die am empfindlichsten auf die Diversifizierung des Virus reagieren. Um die Grundlagen der Neutralisierung und des Entweichens auf atomarer Ebene zu verstehen, verwendeten wir Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und Röntgenkristallographie, um die Strukturen der beiden mAbs TAU-2303 und TAU-2212 zu bestimmen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion von TAU-2303 Fab und SARS-CoV-2 RBD der des ACE2-Rezeptors mit RBD in der „oben“ RBD-Konformation ähnelt. Im Gegensatz dazu weist mAb TAU-2212 eine ungewöhnliche Bindungsart mit Erkennungsflexibilität auf, die fünf verschiedene mögliche Konformationen umfasst, wobei 1–3 Fabs an ein Spike-Trimer binden oder benachbarte Trimer durch die Bildung von Kontakten innerhalb und zwischen den Spikes vernetzen Bevorzugung von RBD in der „unten“-Position. Unsere Studie liefert wichtige mechanistische und strukturelle Erkenntnisse über die Neutralisierung von SARS-CoV-2-VOCs durch natürliche Antikörper sowie molekulare Modellierungsvorhersagen zu mAb-Wechselwirkungen mit der Omicron-Variante.

Die Ergebnisse unserer vorherigen Studie zeigten, dass die mAbs TAU-1145, -2189, -2230 und -2303 mit ACE2 konkurrieren und daher als ACE2bs-mAbs definiert werden, während dies bei den mAbs TAU-1109, -1115, -2220, -2310 nicht der Fall ist konkurrieren mit ACE2 und werden daher als Nicht-ACE2bs9 definiert. Der letzte neutralisierende mAb, TAU-2212, bindet laut ELISA keine löslichen SARS-CoV-2-Antigene (RBD oder Spike) und erkennt ein unbekanntes Epitop9. Um die Erkennung der RBDs aus SARS-CoV-2-VOCs durch unsere zuvor isolierten mAbs zu untersuchen, haben wir lösliche RBD-Proteine ​​erzeugt, die die in den Stämmen Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron identifizierten Mutationen enthalten (Ergänzungstabelle 1) und die Bindung getestet durch die acht mAbs, die ursprünglich eine starke Bindung an den Wildtyp-Stamm RBD9 zeigten. Mit Ausnahme von Alpha beobachteten wir eine Verringerung der Bindungseffizienz der ACE2bs-mAbs an alle VOCs (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1). Dies war am bedeutendsten für Beta-, Delta- und Omicron-RBDs, war jedoch, wenn auch in geringerem Ausmaß, auch für die Gamma-Variante vorhanden. Von den ACE2bs-mAbs behielt nur TAU-2303 seine ursprüngliche Aktivität gegen den Delta-Stamm bei. TAU-2212 bindet kein lösliches RBD und konnte mit diesem Assay nicht bewertet werden9. Um den individuellen Beitrag jeder Mutation zu untersuchen, haben wir RBDs generiert, die einzelne oder doppelte Aminosäuresubstitutionen enthalten, die den Varianten Beta, Gamma und Delta entsprechen. Von den acht getesteten einfach mutierten RBDs hatten sowohl die L452R-Substitution (im Delta-VOC23 vorhanden) als auch die E484K-Substitution (sowohl im Beta- als auch im Gamma-VOC24 vorhanden) einen großen Einfluss auf die Antikörperbindung (Abb. 1b, d und ergänzende Abb. 1). ). Andere Einzelsubstitutionen hatten jedoch keinen Einfluss auf die mAb-Bindung. Darüber hinaus wurden RBDs, die einzelne Mutationen N439K25, Y453F26,27 und A475V28 enthielten, über die in einigen zirkulierenden SARS-CoV-2-Stämmen berichtet wurde, von allen mAbs genauso stark gebunden wie die ursprüngliche Wildtyp-RBD. Interessanterweise war die Bindung von mAb TAU-2303 an die Doppelmutante K417N/N501Y verringert, obwohl jede der beiden Einzelmutanten einzeln keine Wirkung hatte (Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 1). Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass ACE2bs-mAbs empfindlicher auf Mutationen in den RBDs reagieren als Nicht-ACE2bs-mAbs.

ACE2bs- oder Nicht-ACE2bs-Antikörper sind links in jedem Feld angegeben, a–d. Für die Felder a–c stellt jedes Diagramm die Antikörperbindung an Wildtyp- oder VOC- (a), einzelne (b) oder doppelte (c) mutierte RBD dar. AUC wurde mit GraphPad Prism berechnet. Die rohen OD650-Werte sowie die Isotypkontrolle sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt (n ≥ 3). d Zusammenfassung der Antikörperbindungsaffinität zu jedem in dieser Studie generierten RBD. Die grüne Farbe zeigt eine Bindungsaffinität von >75 %, die orange Farbe von 25–75 % und die gelbe von <25 % im Vergleich zum Wildtyp-RBD an. Die VOCs, die jede Mutation beherbergen, sind angegeben.

Mutationen außerhalb des RBD können auch die Aktivität von RBD-bindenden mAbs beeinflussen, indem sie die Konformationsorganisation des Trimers29 verändern. Daher exprimierten wir als nächstes das Spike-Protein voller Länge der Wildtyp-, Alpha-, Beta- und Delta-Varianten (Ergänzungstabelle 1) auf Expi293F-Zellen und testeten die Fähigkeit jedes mAb, die Bindung von löslichem menschlichem ACE2 (hACE2) durch Fluss zu hemmen Zytometrie. Das Gamma-Spike-Protein in voller Länge wurde nicht produziert, da die RBD dieser Variante eine ähnliche Aktivität wie die Beta-RBD aufwies. Wie erwartet hemmten die meisten ACE2bs-mAbs effektiv die ACE2:spikewild-Typ- und ACE2:spikeAlpha-Wechselwirkungen, nicht jedoch die zwischen ACE2:spikeBeta und ACE2:spikeDelta. Der mAb TAU-2212, der in diesem Assay getestet werden kann, zeigte beim Test gegen den Wildtyp, die Alpha- und Delta-Stämme eine 25–40 %ige ACE2:Spike-Hemmung, hatte jedoch keine Aktivität gegen Beta (Abb. 2a, b und ergänzende Abb . 2). Tatsächlich behielt keiner der ACE2bs-mAbs seine ursprüngliche Wirksamkeit gegen die Beta-Variante und gemäß den ELISA-Daten behielt nur der mAb TAU-2303 seine volle Aktivität gegen die Delta-Variante. Wie erwartet wurde für die mAbs TAU-1109, -2310, -1115 und -2220 keine Wirkung beobachtet, da die Neutralisierung nicht durch Rezeptorblockierung erfolgt.

a Durchflusszytometriediagramme, die die Wirksamkeit jedes mAb bei der Beeinträchtigung der Spike:ACE2-Bindung zeigen (weitere Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung 2). Expi293F-Zellen wurden transfiziert, um den Wildtyp-, Alpha-, Beta- oder Delta-Spike zu exprimieren, und mit jedem Antikörper inkubiert, bevor sie mit an APC konjugiertem humanen ACE2 (hACE2) gefärbt wurden. Als Positivkontrolle wurde unmarkiertes hACE2 („kaltes“ hACE2) und als Isotypkontrolle der Antikörper mGO5366 verwendet. In jedem Diagramm zeigt das blaue Histogramm behandelte Zellen an, während das rote unbehandelte Zellen anzeigt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt (n ≥ 3). b Normalisierter Prozentsatz der Spike:ACE2-Hemmung, berechnet durch Messung des Prozentsatzes der hACE2-APC-positiven Zellen in Gegenwart jedes mAb, Division durch den Prozentsatz der hACE2-APC-positiven Zellen (nur hACE2) und Normalisierung auf 100 %. c Kreisdiagramme, die die Häufigkeit von Spike:ACE2-hemmenden mAbs für Wildtyp und VOCs anzeigen.

Als nächstes untersuchten wir die Fähigkeit der mAbs, Infektionen zu verhindern. Wir verwendeten einen pseudoviralen Neutralisationstest und eine Infektion von Vero-TMPRSS2-Zellen mit authentischem SARS-CoV-2, um die Aktivität der neun mAbs gegen SARS-CoV-2-Wildtyp und VOCs zu testen (Abb. 3). Den ELISA- und Durchflusszytometrie-Ergebnissen zufolge verhielt sich Alpha VOC ähnlich wie der Wildtyp-Stamm, während die Beta- und Omicron-Varianten am resistentesten waren, gefolgt von Gamma und Delta. In Übereinstimmung mit den ELISA- und Durchflusszytometrie-Ergebnissen war mAb TAU-2303 der einzige ACE2bs-mAb, der in der Lage war, Delta VOC zu neutralisieren, mit verbesserter Wirksamkeit im Vergleich zum Wildtyp-Stamm (Abb. 3a). Die Nicht-ACE2bs-mAbs TAU-1109 und -2310 behielten ihre Wirksamkeit gegen alle getesteten VOCs, wobei TAU-2310 im Vergleich zum Wildtyp eine verbesserte Aktivität gegen die Delta-Variante aufwies (Abb. 3a, b). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Nicht-ACE2bs-mAbs eine entscheidende unterstützende Rolle spielen, wenn virale Mutationen vorhanden sind, die die Neutralisierung durch ACE2bs-mAbs verhindern. Darüber hinaus zeigt die verbesserte Aktivität der TAU-2310- und TAU-2303-mAbs, wie genetische Variation in einem SARS-CoV-2-VOC die Neutralisierung einiger Klassen von mAbs erhöhen kann.

a Antikörperneutralisationskurven von Wildtyp-, Alpha-, Beta- und Delta-VOC-pseudotypisierten GFP-Reporterviruspartikeln. Für jeden mAb stellt jede Kurve die Hemmung einer VOC dar, wie angegeben. Antikörper wurden mit Viruspartikeln in 8 aufeinanderfolgenden dreifachen Verdünnungen, beginnend bei 10 µg/ml Antikörper, vorinkubiert. Die Fluoreszenz infizierter Zellen wurde 72 Stunden nach der Infektion abgelesen. Der Hemmungsprozentsatz wurde durch Normalisierung auf unbehandelte Zellen berechnet. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt (n = 3). mGO53 wurde als Isotypkontrolle verwendet. Fehlerbalken zeigen SD an. b Infektion von Vero-TMPRSS2-Zellen durch Wildtyp (n = 4), Alpha (n = 2), Beta (n = 4), Gamma (n = 4), Delta und Omicron (n = 6) mit authentischem SARS-CoV -2 und mit Carboxymethylcellulose überzogen. Die Werte werden als infizierte Zelloberfläche ausgedrückt und auf infizierte Zellen ohne mAb normiert. Viruspartikel wurden vor der Zugabe zu den Zellen 1 Stunde lang mit 100 µg/ml Antikörper vorinkubiert. Infizierte Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion mithilfe des SARS-CoV-2-Nukleokapsid-Antikörpers nach Zellfixierung und Permeabilisierung identifiziert. Infizierte Zellen wurden mit Incucyte S3 quantifiziert. mGO53 dient als Isotypkontrolle. Fehlerbalken zeigen SD an.

Die virale Evolution scheint sich in erster Linie auf die ACE2bs-Supersite zu konzentrieren, was mit der allgemeinen Superoir-Potenz rezeptorblockierender mAbs zur Hemmung von SARS-CoV-2 übereinstimmt. Wir beschlossen, uns auf den mAb TAU-2303 zu konzentrieren, der der einzige ACE2bs-mAb ist, der gegen Delta VOC aktiv ist, und auf den mAb TAU-2212, der die Rezeptorbindung durch Erkennung einer Konformationsoberfläche blockiert, und die strukturellen Grundlagen der Neutralisierung für diese weiter zu untersuchen zwei mAbs. Wir haben zunächst die KryoEM-Struktur des Fragments der Antigenbindung (Fab) von TAU-2303 (Fab2303) im Komplex mit dem Ecto-SARS-CoV-2-Spike-Trimer mit einer Auflösung von 4,5 Å bestimmt (Abb. 4a). Die KryoEM-Struktur zeigte, dass ein Fab2303-Molekül ein Spike-Trimer an der hervorstehenden „nach oben“ gerichteten RBD bindet. Daher kann mAb TAU-2303 als mAb vom Typ CoV2130 kategorisiert werden, der zu RBD-bindenden mAbs der Klasse 1 gehört und nur eine RBD-Untereinheit unter den drei verfügbaren Untereinheiten des Trimers bindet (Abb. 4a). Wir haben Fab2303 auch im Komplex mit SARS-CoV-2 RBD kristallisiert und die Struktur mit einer Auflösung von 2,42 Å analysiert (Abb. 4b, Tabelle 1). Die Ergebnisse sowohl der Kristall- als auch der KryoEM-Strukturen zeigten, dass der Fab2303-RBD-Komplex eine große vergrabene Oberfläche von 1185 Å2 aufweist, wobei der Großteil der Kontaktoberfläche (64 %) von der schweren Kette von Fab2303 und nur 36 % von der leichten Kette stammt Kette. Insgesamt 29 RBD-Reste in der Kristallstruktur haben direkten engen Kontakt mit Fab2303 (Ergänzungstabelle 2). In Übereinstimmung mit der Kontaktoberflächenanalyse stammen 19 dieser Reste aus der schweren Kette (HC), während 10 aus der leichten Kette (LC) von TAU-2303 stammen. Die Kontaktreste vermitteln die Bildung von 23 Wasserstoffbrückenbindungen (Ergänzungstabelle 2). Dazu gehören fünf Wasserstoffbrückenbindungen RBD-D420OD2 – Fab2303-HC-S56OG, RBD-Y473OH – Fab2303-HC-S31O, RBD-T415OG1 – Fab2303-HC-Y58OH, RBD-L455O – Fab2303-HC-Y33OH und RBD-Q493NE2 – Fab2303-HC-Y102OH mit Abständen von unter 2,7 Å (Ergänzungstabelle 2). In Übereinstimmung mit der Biochemie und den In-vitro-Zelltests 14 (K417, T453, L455, A475, F486, N487, Y489, Q493, G496, Q498, T500, N501, G502 und Y505) der 29 Kontakte zwischen Fab2303 und RBD sind auch an der Bindung des ACE2-Rezeptors beteiligt, was bestätigt, dass TAU-2303 das Virus neutralisiert, indem es die Rezeptorbindung blockiert (Abb. 1–3, 4b und ergänzende Abb. 1,2). Der Annäherungswinkel, durch den Fab2303 RBD bindet, beträgt 25° relativ zu dem von ACE2 (Abb. 4b). Weitere Vergleiche ergaben, dass der Bindungsmodus von mAb TAU-2303 dem anderer neutralisierender Antikörper der Klasse 1 ähnelt, die auf RBD abzielen (ergänzende Abbildung 3a, b)30,31,32.

a Banddiagramme, die die KryoEM-Struktur des SARS-CoV-2-Spike-Trimers im Komplex mit einem TAU-2303-Fab (Fab2303) zeigen. Das „obere“ RBD-Protomer des Spikes ist blau gefärbt. Die anderen beiden Protomer sind gefärbter Lachs. Die schwere Kette von Fab2303 ist rosa und die leichte Kette ist cyanfarben. b Links: Banddiagramme, die die Fab2303-RBD-Kristallstruktur über der ACE2-RBD-Kristallstruktur (PDB: 6M0J) zeigen. Der RBD und Fab2303 sind wie in a gefärbt. ACE2 ist grün gefärbt. Die durchgezogenen und gestrichelten Linien in Rot zeigen die Längsachsen von ACE2 bzw. Fab2303 an. Rechts: Paratop und Epitop von Fab2303, dargestellt als gerenderte Oberflächendarstellungen. Das Paratop auf Fab2303 und das Epitop auf RBD sind gelb gefärbt. Rote Linien zeigen den Fußabdruck von ACE2. c Detaillierte Wechselwirkungen zwischen Fab2303 und SARS-CoV-2 RBD. HCDR und LCDR stehen für die komplementaritätsbestimmende Region (CDR) der schweren bzw. leichten Kette. LFR steht für Gerüstregion der leichten Kette. d Strukturvergleiche von RBD mit den RBD-Mutanten K417N, K417T, N501Y und E484K. Die Strukturen der Mutanten wurden in COOT53 mithilfe der Single-Mutate-Funktion modelliert, bei der nur die Seitenketten der mutierten Reste verändert wurden. Die meisten möglichen Seitenkettenkonformationen der mutierten Reste wurden generiert und aus der Rotamer-Bibliothek von COOT und entsprechend der mit PISA berechneten Bindungsenergie ausgewählt. Die schwere Kette von Fab2303 ist rosa und die leichte Kette ist cyanfarben. RBD und Fab2303 sind wie in a gefärbt, wobei die mutierten RBD-Reste grün sind. e Oberflächenkartierung von Schlüsselmutationen in verschiedenen Varianten und der Positionen der mutierten Stellen relativ zu den von TAU-2303 erkannten Bindungsepitopen. Die Bindungsepitope von TAU-2303 sind gelb gefärbt. Die Mutationsstellen innerhalb oder außerhalb des Bindungsepitops von TAU-2303 sind rot bzw. grün gefärbt.

Die ELISA-Ergebnisse zeigten eine Verringerung der TAU-2303-Bindung an RBD mit den Doppelmutationen K417N/N501Y, jedoch nicht an K417T/N501Y oder einer der Einzelmutationen K417N, K417T oder N501Y (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). . Dies stimmt mit den Kristallstrukturbefunden überein, dass die Reste K417 und N501 beide in direktem Kontakt mit TAU-2303 stehen. Position 417 ist besonders wichtig für die TAU-2303-Erkennung, da Fab2303-HC-Y52OH Wasserstoffbrücken sowohl mit dem Hauptkettenatom N als auch mit dem Seitenkettenatom NH von RBD-K417 bildet (Abb. 4c, d und Ergänzungstabelle 2). Die Modellierung ergab, dass beim Ersetzen von Lysin in Position 417 durch Threonin sowohl die Wasserstoffbrückenbindungen in der Hauptkette als auch in der Seitenkette erhalten bleiben könnten (Abb. 4d). Darüber hinaus wird es möglich, eine neue Wasserstoffbrücke zwischen dem OH-Atom des Threonins und dem OH-Atom Fab2303-HC-Y33 aufzubauen, wodurch die mit PISA33 berechnete Gesamtbindungsenergie von -9,7 kJ/mol auf -9,9 kJ/mol sinkt. Im Gegensatz dazu erhöht der Ersatz von Lysin in Position 417 durch Asparagin die Länge der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den polaren Seitenkettenatomen ND2H oder OD1 mit Fab2303-HC-Y33 und Fab2303-HC-Y52, was, wie angegeben, die Begünstigung der Wechselwirkung verringert durch die Erhöhung der berechneten Bindungsenergie von -9,7 kJ/mol auf -9,5 kJ/mol (Abb. 4d). Das Asparagin in Position 501 hat relativ viele Kontakte mit Fab2303. Die N501-Seitenkette bildet zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit Hauptketten- und Seitenkettenatomen von Fab2303-LC-S30 (Abb. 4c). Während diese Wasserstoffbrückenbindungen durch den Ersatz von Asparagin durch Tyrosin vollständig zerstört würden, deuten unsere Modelldaten darauf hin, dass mit Tyrosin in dieser Position neue Van-der-Waals-Wechselwirkungen gebildet werden könnten (Abb. 4d). Da diese vorgeschlagenen Van-der-Waals-Wechselwirkungen die verlorenen Wasserstoffbrückenbindungen nicht vollständig kompensieren könnten, wird vorausgesagt, dass die Mutante N501Y eine etwas geringere Bindungsaffinität zu Fab2303 aufweist, was durch Affinitätsmessungen mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) bestätigt wird (ergänzende Abbildung). . 3c, d). Obwohl gezeigt wurde, dass Glutamat in Position 484 eine zentrale Rolle bei der Virusflucht vor neutralisierenden Antikörpern spielt34,35,36, weist unsere Strukturanalyse interessanterweise darauf hin, dass E484 keine direkten Wechselwirkungen mit Fab2303 eingeht. Dieser Punkt wurde durch weitere Untersuchung der RBD- und Fab2303-Schnittstelle geklärt, die ergab, dass E484 über ein Wassermolekül mit Fab2303-HC-Y102 interagiert (Abb. 4d). Die Beobachtung, dass lösungsmittelvermittelte Wechselwirkungen normalerweise schwächer sind als direkte Kontakte, steht im Einklang mit den Ergebnissen unserer Funktionsstudien, dass im Gegensatz zu den anderen ACE2bs-mAbs die einzelne E484K-Mutation keinen signifikanten Einfluss auf die TAU-2303-Bindung hatte (Abb. 1). und ergänzende Abbildung 1). Die Mutationen T487K und L452R von RBDDelta befinden sich außerhalb des Bindungsepitops von Fab2303, was erklärt, wie TAU-2303 immer noch mit hoher Affinität binden und das Delta VOC neutralisieren kann (Abb. 4e und ergänzende Abb. 3c, d). Die Struktur- und Modellierungsdaten erklären, warum TAU-2303 gleich gut an ein RBD-Molekül mit einer einzelnen Mutation wie K417N, E484K und N501Y binden kann, nicht jedoch an eine RBD-Mutante mit allen drei Mutationen, wobei der kumulative Bindungsverlust größer ist Energie. Unsere Strukturdaten, die die Biochemie- und Neutralisierungsergebnisse kombinieren, legen nahe, dass die Kombination von RBD-Mutationen eine Schlüsselrolle bei der Verleihung einer SARS-CoV-2-Resistenz spielen könnte. Bezeichnenderweise weist die Omicron-Variante Mutationen in sieben Resten innerhalb des Bindungsepitops von Fab2303 auf, darunter vier wichtige Kontaktreste K417, Q493, Q498 und Y505, was die strukturelle Erklärung für die fehlende Neutralisierung von Omicron durch TAU-2303 liefert (Abb. 3 und 4e).

TAU-2212 ist einer der wirksamsten mAbs in unserem Panel, und obwohl er laut ELISA nicht in der Lage ist, lösliches RBD zu binden, hemmt er die ACE2-Bindung, wie durch Durchflusszytometrie gemessen, was darauf hindeutet, dass die Rezeptorbindung durch einen anderen Mechanismus blockiert wird als den, der von verwendet wird TAU-2303. Um den Neutralisierungsmechanismus von TAU-2212 zu untersuchen, haben wir Fab2212 durch Spaltung des mAb TAU-2212 mit Papain hergestellt. Das gereinigte Fab2212 wurde kristallisiert und der Kristall wurde auf 2,7 Å gebeugt. Die Datenanalyse ergab, dass der Kristall zur Raumgruppe P65 mit den Zellabmessungen a = 75,98 Å, b = 75,98 Å und c = 348,14 Å gehört (Tabelle 1) und zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit aufweist. Die Struktur wurde durch molekularen Austausch bestimmt und auf ein endgültiges R/Rfree von 0,202/0,246 verfeinert. Das endgültige Modell von Fab2212 enthält 419 Reste, während die Reste 141–151 und 197–204 der schweren Kette in der Karte nicht sichtbar sind (Abb. 5a). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Molekülen in der asymmetrischen Einheit beobachtet (ein berechneter RMSD von 0,77 Å zwischen den ausgerichteten Calpha-Atomen, ergänzende Abbildung 4). Fab2212 ist nicht in der Lage, einen stabilen Komplex mit der vor der Fusion stabilisierten SARS-CoV-2-Spike-Ektodomäne zu bilden (ergänzende Abbildung 5a), interagiert jedoch mit dem Spike-Trimer auf der Zelloberfläche9. Unter der Annahme, dass TAU-2212 eine spezifische Konformation des Präfusions-Spike-Trimers bindet, die beim Auftragen auf ELISA-Platten nicht stabil ist, verwendeten wir mit TAU-2212-Protein A beschichtete Perlen, um Spike-Trimere herunterzuziehen, die dann einer KryoEM-Strukturanalyse unterzogen wurden . Die dreidimensionale (3D) Klassifizierung der Partikel durch CryoEM ergab, dass TAU-2212 das Spike-Trimer in fünf unterschiedlichen Konformationen (1–5) bindet, mit 20339, 15868, 14193, 72056 bzw. 39788 Partikeln (ergänzende Abbildung 6 und). Tabelle 2). In allen fünf Konformationen ist nur der Fab-Teil des mAb TAU-2212 sichtbar, während die hochflexible Fc-Region in den rekonstruierten Karten nicht zu sehen ist. Die Konformationen 1, 3 und 4 bestehen aus zwei, drei bzw. drei gebundenen Fabs, wobei sich alle RBDs in der „unten“-Position befinden. Im Gegensatz dazu weist Konformation 2 ein Fab pro Trimer auf, mit einem RBD in der „oben“-Konfiguration, während die anderen RBDs, die durch das Fab gebunden sind, in der „unten“-Konfiguration erscheinen. Konformation 5 weist zwei Kopf-an-Kopf-Spike-Proteine ​​auf, die durch drei mAbs vernetzt sind (Abb. 5b, c).

ein Banddiagramm, das die Kristallstruktur von Fab2212 zeigt. Die schweren und leichten Ketten sind rosa bzw. hellgrün gefärbt. Die CDR-Schleifen sind gelb gefärbt. Die fehlenden Reste 141–151 und 197–204 der schweren Kette sind als rosa gestrichelte Linien dargestellt. b Oberflächendiagramme, die die Seitenansicht (links) und die offene Ansicht von oben (rechts) des Spike-Trimers mit drei gebundenen Fabs von mAb TAU-2212 zeigen. Die RBDs des Spike-Trimers sind blau gefärbt und die schweren und leichten Ketten von Fab2212 sind wie in a gefärbt. Die Bindungsepitope der schweren und leichten Ketten rund um die Verbindungsstelle zweier RBDs sind gelb bzw. weiß gefärbt. Der Rückstand E484 ist rot markiert. c Oberflächen- (oben) und Banddiagramme (unten), die die fünf Konformationen des TAU-2212-Spike-Komplexes zeigen. Die schweren und leichten Ketten der gebundenen mAbs sind wie in a gefärbt. Die Ährentrimere sind grau. Die Zahlenpaare X, X' geben Fabs aus demselben mAb an. d Detaillierte Wechselwirkungen zwischen TAU-2212 und dem Spike-Trimer, veranschaulicht mit der hochauflösenden Konformation 1-Struktur. CDR-Schleifen der schweren und leichten Kette, die an direkten Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Rosa bzw. Cyan dargestellt. Reste, die an der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, werden in Stäbchen mit rot bzw. blau gefärbten Sauerstoff- und Stickstoffatomen dargestellt. e Band- und Stabdiagramme, die die Zerstörung der wichtigsten Wasserstoffbrückenbindungen in E484 durch die E484K-Mutation zeigen. f Oberflächendiagramme, die die Kartierung von Schlüsselmutationen in verschiedenen Varianten und die Positionen der mutierten Stellen im Verhältnis zu den von TAU-2212 erkannten Bindungsepitopen zeigen. Die Epitope der schweren und leichten Kette von TAU-2212 sind gelb bzw. weiß gefärbt. Die Mutationsstellen innerhalb oder außerhalb des Bindungsepitops von TAU-2212 sind rot bzw. grün gefärbt. g Strukturvergleiche der Fabs in den Konformationen 1, 4 und 5. Die Alignments wurden unter Verwendung der RBDs (in grau) und der variablen Regionen der gebundenen Fabs durchgeführt. Die gebundenen Fabs der Konformationen 1, 4 und 5 sind orange, schwarz bzw. blau gefärbt.

Wir haben die Strukturen aller fünf Konformationen mit Auflösungen von 4,7 Å, 7,3 Å, 6,4 Å, 3,3 Å und 9,4 Å (6,1 Å für die geteilte Einzelspitze mit drei Fabs) bestimmt (Abb. 5b, c, Tabelle 2 und Ergänzung). Abb. 6,7). Für Konformation 4, bei der die Auflösung die Erstellung und Verfeinerung von Ab-initio-Modellen ermöglicht (ergänzende Abbildung 8), wurde ein Atommodell der Komplexe mit der Kristallstruktur von Fab2212 und der KryoEM-Struktur des Spike-Trimers (PDB: 6XEY) als Referenzen erstellt (Tabelle 2). Da die Auflösung der Karten der Konformationen 1–3 und 5 für die Erstellung von Ab-initio-Modellen zu gering ist, wurden Atommodelle der Komplexe erstellt, indem die Kristallstruktur von Fab2212 und die KryoEM-Struktur des S-Trimers in KryoEM-Karten eingepasst wurden.

In der Konformation 4 des TAU-2212:Spike-Komplexes befinden sich alle RBDs in der „unten“-Position, wobei drei TAU-2212-Einheiten in der Nähe der Verbindungsstellen zwischen den RBDs binden. Jeder Fab2212 bindet und vernetzt zwei benachbarte „unten“ RBDs (RBD1 und 2) mit einer vergrabenen Oberfläche von 823 Å2 auf RBD1 und 298 Å2 auf RBD2 (Abb. 5b). Der Vergleich der Strukturen der an TAU-2212 gebundenen und freien Spikes ergab, dass die Bindung von TAU-2212 Konformationsänderungen in den RBDs induziert, was zu einer Drehung gegen den Uhrzeigersinn um 4,1° in Richtung der Symmetrieachse führt und danach zu einer kompakteren RBD-Kopfstruktur führt TAU-2212-Bindung (ergänzende Abbildung 9a). Die Konformationsänderungen in den RBDs bringen Reste an den Grenzflächen näher zusammen und können die Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen den RBDs verstärken. Es werden jedoch keine zusätzlichen Kontakte zwischen den „unten“ RBDs beobachtet. Darüber hinaus sind die in freien Spikes ungeordneten RBD-Schleifen 454–462 und 468–489 in der komplexen Struktur gut geordnet, indem sie drei Wasserstoffbrückenbindungen mit dem gebundenen TAU-2212 bilden (ergänzende Abbildung 9b und ergänzende Tabelle 3). Diese Schleifen werden auch bei der ACE2-Bindung geordnet und sichtbar. Diese Daten legen nahe, dass TAU-2212 durch Bindung und Stabilisierung des SARS-CoV-2-Spike-Trimers in einer „unten“-Ausrichtung wirkt und die Konformationsänderung zu „oben“ RBD verhindert, die für Spike:ACE2-Wechselwirkungen erforderlich ist.

Der größte Teil des vom mAb TAU-2212 erkannten Epitops befindet sich auf einem der beiden RBDs (RBD1), und die Wechselwirkungen erfolgen vorwiegend über die schwere Kette, insbesondere die CDR3-Schleife der schweren Kette (HCDR3), die in die Schnittstelle von eingebettet ist zwei RBDs. Zwei CDR-Schleifen der leichten Kette interagieren direkt mit zwei Resten auf RBD1 (485–486), einschließlich der Wasserstoffbrücke, die zwischen dem N-Atom von F486RBD1 und der OH-Gruppe von Fab2212-HC-Y93 gebildet wird (Abb. 5d). Insgesamt umfassen die Wechselwirkungen zwischen den HCDR-Schleifen und RBD1 und RBD2 57 Reste und 13 Paare von Wasserstoffbrückenbindungen (Abb. 5d und Ergänzungstabelle 3). Zu diesen Wechselwirkungen gehören zwei Wasserstoffbrückenbindungen, die von der OE2-Gruppe von E484RBD1 mit der OH-Gruppe von Fab2212-HC-Y33 und der ND2-Gruppe von Fab2212-HC-N52 gebildet werden. Die Länge der Wasserstoffbrücke zwischen der OE2-Gruppe von E484RBD1 und der OH-Gruppe von Fab2212-HC-Y33 beträgt 2,2 Å, was darauf hindeutet, dass diese Wasserstoffbrücke die Hauptwechselwirkung an der Kontaktschnittstelle sein könnte. Die E484K-Mutation unterbricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Antikörper und dem RBD vollständig (Abb. 5e und ergänzende Abb. 5b) und liefert eine strukturelle Erklärung für die vollständige Resistenz der Beta- und Gamma-VOCs gegenüber TAU-2212. In ähnlicher Weise wird davon ausgegangen, dass sowohl die E484A- als auch die Q493R-Mutation, die in der Omicron-Variante vorhanden ist, die wichtigsten Wasserstoffbrückenbindungen zerstören und daher voraussichtlich die TAU-2212-Bindung beeinflussen und die Neutralisationskapazität verringern (Abb. 5f). Der Ersatz S373P, der in der neuen Omicron-Variante vorhanden ist, liegt ebenfalls in der TAU-2212-Schnittstelle. Um die Auswirkung der S373P-Mutation auf die TAU-2212-Bindung zu testen, führten wir zunächst eine S373G-Mutation ein, um die durch die Hydroxylgruppe von Serin 373 vermittelte Wasserstoffbindung zu zerstören. Die Ergebnisse zeigten, dass die S373-vermittelte Wasserstoffbindung die Bindung von TAU-2212 nicht beeinflusste (Ergänzende Abbildung 5b). Als nächstes führten wir ein Pulldown-Experiment durch, um die Wechselwirkung zwischen der Mutante S373P und TAU-2212 zu testen (ergänzende Abbildung 5c). Die Ergebnisse zeigten, dass TAU-2212 immer noch Spike mit der S373P-Mutation binden kann, was weiter dafür spricht, dass sowohl die Wasserstoffbrücke als auch die durch die S373-Seitenkette vermittelte Van-der-Waals-Kraft keine große Rolle bei der Bindung von TAU-2212 Spike spielen. Wenn man die Wirkung aller Mutationen zusammen betrachtet, ist es daher nicht verwunderlich, dass TAU-2212 Omicron nicht neutralisiert.

Angesichts der Flexibilität und Dynamik der Wechselwirkung zwischen TAU-2212 und dem Spike-Trimer untersuchten wir die Bindung der variablen Regionen von Fab2212 an die benachbarten RBDs in den Konformationen 1–5. Wir stellten fest, dass die Dichten der gebundenen Fabs2212 in Konformation 2 erheblich schwächer waren als in den anderen Konformationen, was darauf hindeutet, dass die Konfiguration „eins nach oben“ – „zwei nach unten“ möglicherweise nicht günstig für die TAU-2212-Bindung ist (Abb. 5c). Diese Möglichkeit wurde auch durch die Pulldown-Ergebnisse nahegelegt. Um den TAU-2212: Spike-Komplex zu erhalten, haben wir mehr Spike aufgetragen und ein großer Teil des Spike-Proteins befand sich im Durchfluss, der sich wahrscheinlich in der RBD-„oben“-Konformation befindet. Die Strukturanalyse der gebundenen Fabs zeigte, dass die konstanten Regionen der drei gebundenen Fabs in Konformation 4 (drei Fabs, die drei „nach unten gerichtete“ RBDs binden) in einem kleinen Biegewinkel (14,6°) relativ zu den variablen Regionen positioniert sind, mit denen sie ausgerichtet sind die z-Achse (Abb. 5g). Darüber hinaus sind die drei Moleküle gut getrennt (Abb. 5c) und der Abstand zwischen den beiden C254s, die eine Disulfidbindung bilden und Schleifen der gebundenen Fabs vernetzen, beträgt ~21 Å (ergänzende Abb. 10), was darauf hindeutet, dass die drei gebundenen Fabs gehören zu drei verschiedenen mAbs, anstatt dass ein mAb das Trimer mit beiden Armen bindet. Die konstanten und variablen Domänen der gebundenen Fabs in Konformation 5 nehmen ähnliche Konformationen an wie die in Konformation 4, was darauf hindeutet, dass die gebundenen Fabs in Konformation 5 zu drei verschiedenen mAbs gehören. Im Gegensatz zur Konformation 4 sind in Konformation 1 nur zwei Fabs pro Trimer vorhanden. Die konstanten Regionen der beiden gebundenen Fabs in Konformation 1 haben einen großen Biegewinkel (29,6°) und sind am distalen Ende verbunden. Darüber hinaus haben die beiden C254s, die die Schleifen der gebundenen Fabs vernetzen, einen angemessenen Abstand von 4 Å (ergänzende Abbildung 10), was darauf hindeutet, dass in diesem Fall die beiden gebundenen Fabs zum selben mAb gehören (Abb. 5c und ergänzende Abbildung). 10). Bemerkenswert ist, dass Konformation 3 die drei gebundenen Fabs in zwei unterschiedlichen Konformationen aufweist. Zwei der Fabs haben einen ähnlichen Biegewinkel wie in Konformation 1, während einer der Fabs einen ähnlichen Biegewinkel wie in Konformation 5 aufweist, was darauf hinweist, dass die Bindung von TAU-2212 in Konformation 3 in einem gemischten Modus mit zwei mAbs erfolgt . Unter diesen steuert ein mAb zwei Fabs bei, während ein mAb nur ein Fab bereitstellt (Abb. 5c).

Die Strukturanalyse der Kopf-an-Kopf-Spikes in Konformation 5 zeigt drei mAbs, die zwei Spikes vernetzen, wobei sich die beiden Fabs jedes mAb in zwei linear ausgerichteten, um 180° entgegengesetzten Positionen befinden (Abb. 5c und ergänzende Abb. 10c). Infolgedessen weist der konstante Bereich des gebundenen Fab in Konformation 5 den kleinsten Biegewinkel auf und liegt nahezu in einer Ebene mit dem variablen Bereich. Angesichts der Tatsache, dass die meisten Partikel in Konformation 4 vorliegen und bei allen „Down“-RBDs und einem einzelnen gebundenen TAU-2212 keine Spike-Trimere beobachtet wurden, können wir daraus schließen, dass die Bindung eines einzelnen TAU-2212-mAb an das Down-RBD-Trimer eine Konformationsänderung auslöst das fördert eine zusätzliche Fab-Bindung. Mit der Bindung des ersten Fab wird das zweite Fab des gebundenen mAb dazu neigen, das benachbarte Epitop zu binden. Die Bindung beider Fabs in einem mAb führt jedoch zu einer Biegung der gebundenen Fabs, wie in Konformation 2 gezeigt, was die Stabilität der Wechselwirkung verringert. Somit könnte der Bindungsmodus in Konformation 1 bald durch den Bindungsmodus in Konformation 4 ersetzt werden, während Konformation 3 wahrscheinlich ein Zwischenzustand zwischen den Konformationen 1 und 4 ist. Zusammengenommen nimmt mAb TAU-2212 einen einzigartigen Bindungsmodus an den Spike an. mAb TAU-2212 erkennt benachbarte RBDs in einer „Down“-Konformation und vernetzt zwei einander zugewandte Spikes. Ein einzelner Fab2212 bindet jedoch kaum das Spike-Trimer, was sich völlig von den mAbs S2M1137 und C14438 unterscheidet. Wie mAb TAU-2212 könnten auch S2M11- und C144-IgGs die Kopf-an-Kopf-Spike-Verknüpfung verursachen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass natürliches IgG auch Spikes vernetzen und die Aggregation von Viruspartikeln fördern kann, wie es der „bispezifische“ Nanokörper Fu2 tut39, obwohl die RBD-Konformation und Epitope in diesen Komplexen unterschiedlich sind.

Trotz des relativ stabilen Genoms von SARS-CoV-240 ging die anhaltende Ausbreitung der globalen Pandemie mit der Entstehung neuer Varianten mit verbesserter Übertragbarkeit und Mutationen einher, die zur Immunumgehung beitragen25,41,42,43,44. Aufgrund der erhöhten Affinität zu menschlichen Zellen und Veränderungen an gefährdeten Rückständen innerhalb des Spikes können diese neuen Varianten sowohl mAb-Therapien als auch Impfstoffe gefährden. Von besonderem Interesse sind die VOCs Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron, da sie in den nachfolgenden „Wellen“ der Pandemie den ursprünglichen Wuhan-Hu-1-Stamm vollständig ersetzten. Im ersten Teil unserer Studie wurde die Bindungshemmung und Neutralisierung von neun Antikörpern untersucht, die zuvor aus mit Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 infizierten Personen isoliert wurden9. In Übereinstimmung mit anderen Berichten45,46 zeigen wir, dass ACE2bs-mAbs stärker von viralen Mutationen betroffen sind als mAbs, die an Regionen außerhalb der ACE2bs binden. Während diese im Allgemeinen weniger wirksam gegen das ursprünglich infizierende Virus sind, scheinen Nicht-ACE2bs-mAbs eine breitere Aktivität gegen neu auftretende Varianten zu haben.

Im zweiten Teil unserer Studie untersuchten wir den Mechanismus der Neutralisierung zweier neutralisierender rezeptorblockierender mAbs, TAU-2303 und TAU-2212, auf atomarer Ebene. Die atomare Struktur von Fab2303:RBD bestätigte, dass TAU-2303 eine Oberfläche bindet, die auch vom ACE2-Rezeptor gebunden wird, wie wir durch funktionelle Tests beobachtet haben. Im Gegensatz zu anderen ACE2bs-mAbs in unserer Studie blieb TAU-2303 gegen die Delta-VOC aktiv, was wahrscheinlich auf die vergleichbaren Bindungsmodi von ACE2 und TAU-2303 in Bezug auf Epitop und Annäherungswinkel an die RBD zurückzuführen ist. Allerdings war TAU-2303, wie die meisten mAbs, die die Rezeptorbindung blockieren, weniger wirksam gegen die Beta-Variante und völlig wirkungslos gegen die Omicron-Variante. Als nächstes untersuchten wir den atypischen mAb TAU-2212, der eine ungewöhnliche Bindungsart mit Erkennungsflexibilität aufweist, die fünf verschiedene Konformationen umfasst. TAU-2212 bindet und vernetzt „unten“ RBDs, indem es eine außergewöhnliche Konformationsflexibilität zeigt. Entsprechend der angepassten Struktur jeder Konformation sind die Schnittstellen zwischen dem RBD und der variablen Region des gebundenen Fab2212 konsistent. Wir gingen davon aus, dass die Bindungsoberfläche bei allen fünf Konformationen gleich bleibt. Die Beobachtung, dass TAU-2212 den Spike-Komplex in fünf verschiedenen Konformationen bindet, lässt auf eine Flexibilität der Neutralisierung schließen, die auch durch die Stabilisierung des Spike-Trimers erreicht wird. Das Vorhandensein einer großen Anzahl von TAU-2212-mAb, die mit Kopf-an-Kopf-Spikes vernetzt sind, legt nahe, dass TAU-2212 Viruspartikel wirksam vernetzen und aggregieren und dadurch die Anzahl wirksamer Viruspartikel in der Lunge reduzieren kann. Darüber hinaus würde der Bindungsmodus in den Konformationen 1, 3, 4 oder 5 jede „oben“-Konformation der RBDs blockieren und somit die Rezeptorbindung blockieren. Auf diese Weise weist TAU-2212 ACE2bs-ähnliche Eigenschaften auf und nutzt gleichzeitig einen bestimmten Wirkmechanismus. Alternative Strategien zur Erweiterung der Neutralisationskapazität lassen sich aus den zuvor berichteten Antikörpern S2M11 und C144 ableiten, die zwei „Down“-RBDs vernetzen und einen ähnlichen Bindungsmodus wie TAU-2212 aufweisen (ergänzende Abbildung 11). Im Gegensatz zu TAU-2212 können jedoch sowohl S2M11 als auch C144 das Spike-Trimer allein mit dem Fab binden. Von den drei Antikörpern weist S2M11 die größte Bindungsschnittstelle auf, während die Bindungsschnittstellen von TAU-2212 und C144 kleiner und ähnlicher sind (ergänzende Abbildung 11). Wie TAU-2212 fördert der S2M11-mAb einen kompakten RBD-Kopf, während die C144-Bindung den gegenteiligen Effekt fördert, indem sie den RBD-Kopf in eine offene Konformation zwingt (ergänzende Abbildung 11b). Die größere Bindungsschnittstelle von S2M11 umfasst E484- und L452-Reste und wird daher voraussichtlich an Wirksamkeit gegenüber den Beta-, Gamma- und Delta-Varianten verlieren, wohingegen TAU-2212 Delta effektiv neutralisiert (Abb. 3 und ergänzende Abb. 11). Wie andere mAbs seiner Klasse zeigte auch TAU-2212 einen vollständigen Aktivitätsverlust gegenüber den VOCs Beta, Gamma und Omicron.

Zusammenfassend liefert unsere Studie funktionelle und strukturelle Daten auf atomarer Ebene zu den Wechselwirkungen zwischen natürlich hervorgerufenen Antikörpern und SARS-CoV-2-Varianten. Sowohl TAU-2303 als auch TAU-2212 wirken stark neutralisierend, entstehen jedoch durch unterschiedliche B-Zell-Entwicklungsprogramme. Die Neutralisierung durch TAU-2212 gelingt bei den meisten Mutationen mit Ausnahme von E484K. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Kombination von mAbs, die E484K binden können, wie z. B. TAU-1109, −2303 oder −2310, mit TAU-2212 für die antivirale Neutralisierung mit breitem Spektrum nützlich sein könnte.

Wir verwendeten unser zuvor beschriebenes Wildtyp-Plasmid9 als Vorlage für die PCR-Mutagenese, um RBD-Konstrukte zu erzeugen, die einzelne Aminosäuremutationen enthalten. Paare überlappender DNA-Primer mit einer oder zwei Basenpaarsubstitutionen, flankiert von 20 Basen auf jeder Seite, wurden von Syntezza-Israel entworfen und synthetisiert. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) DNA-Polymerase durchgeführt. Jede PCR-Reaktion enthielt 10 µL KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 0,5 µM jedes Primers und 1 ng Template-DNA, wobei das Probenvolumen mit DNase/RNase-freiem Wasser (Bio-Lab) auf 20 µL eingestellt wurde. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95 °C für 3 Minuten, 16 Zyklen mit 98 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden. Doppelte und dreifache Aminosäuremutanten wurden auf ähnliche Weise mit geeigneten Templaten und Primern erzeugt.

Jedes Konstrukt wurde zur vorübergehenden Transfektion von Expi293F-Zellen (Thermo Fisher) unter Verwendung des ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher) verwendet. Sieben Tage nach der Transfektion wurde der Zellüberstand gesammelt, filtriert (0,22 µm) und mit Ni2+-NTA-Agarosekügelchen (GE Life Sciences) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Proteine ​​wurden mit 200 mM Imidazol eluiert, gegen PBS × 1 gepuffert, aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

Hochbindende ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning Nr. 9018) wurden über Nacht bei 4 °C mit 1 µg/ml RBD in PBS × 1 beschichtet. Am folgenden Tag wurde die Beschichtung verworfen, die Vertiefungen mit „Waschpuffer“ (PBS × 1 und 0,05 % Tween20) gewaschen und 2 Stunden lang bei RT mit 200 µL „Blockierungspuffer“ (PBS × 1, 3 %) blockiert. BSA (MP Biomedicals), 20 mM EDTA und 0,05 % Tween20 (Sigma)). Antikörper wurden in einer Anfangskonzentration von 4 µg/ml und sieben weitere 4-fache Verdünnungen in Blockierungspuffer hinzugefügt und 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen, bevor sekundärer, an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierter Anti-Human-IgG-Antikörper (Jackson ImmunoResearch), 1:5000 in Blockierungspuffer verdünnt, hinzugefügt und 1 Stunde lang bei RT inkubiert wurde. Nach vier weiteren Waschgängen wurden 100 µL TMB (Abcam) in jede Vertiefung gegeben und die Absorption bei 650 nm nach 20 Minuten abgelesen (BioTek 800 TS).

Expi293F-Zellen wurden mit pcDNA 3.1, das SΔC19 der Wildtyp-, Alpha-, Beta- oder Delta-Varianten enthielt, unter Verwendung des ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher) transfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen geerntet, bei 300 × g zentrifugiert und in FACS-Puffer (PBS × 1, 2 % FBS und 2 mM EDTA) resuspendiert. Als nächstes wurden die Zellen in eine Platte mit 24 Vertiefungen (Corning) aliquotiert, sodass jede Vertiefung 3 × 106 Zellen in 1 ml FACS-Puffer enthielt. TAU-Antikörper oder mGO53 wurden in einer Konzentration von 20 µg/ml mit unmarkiertem hACE2 in einer Konzentration von 1 µg/ml in die entsprechenden Vertiefungen gegeben. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang in einem 8 % CO2-Inkubator unter leichtem Schütteln inkubiert, in FACS-Röhrchen überführt, mit FACS-Puffer gewaschen und mit biotinyliertem hACE2 20 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Nach einem zusätzlichen Waschschritt wurden die Zellen mit 0,5 µg Streptavidin-APC (Miltenyi Biotec, 130-106-792) inkubiert und erneut gewaschen. Die APC-Fluoreszenz wurde mit einem CytoFLEX S4 (Beckman Coulter) aufgezeichnet.

SARS-CoV-2-Spike-Pseudopartikel wurden durch Cotransfektion von Expi293F-Zellen mit pCMV delta R8.2, pLenti-GFP (Genecopoeia) und pcDNA 3.1 SΔC19 (Thermo Fisher) im Verhältnis 1:2:1 erhalten. bzw. entsprechend den Herstellerangaben. Der Überstand wurde 72 Stunden nach der Transfektion geerntet, 10 Minuten bei 1500 × g zentrifugiert und durch einen 0,45 μm-Filter (LIFEGENE, Israel) geleitet. Der Überstand wurde dann mit einem Amicon Ultra mit einem Cutoff von 100 KDa bei 16 °C (Merck Millipore) auf 5 % seines ursprünglichen Volumens konzentriert. HEK-293-Zellen, die hACE2 stabil exprimieren, wurden in mit 0,1 % Gelatine beschichteten 96-Well-Platten (Greiner) mit einer Anfangsdichte von 0,75 × 105 Zellen pro Well ausgesät. Am folgenden Tag wurden konzentrierte Pseudopartikel mit Reihenverdünnungen von Antikörpern 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und zu den 96-Well-Platten gegeben. Nach 48 Stunden wurde das Zellmedium durch frisches DMEM-Medium ohne Phenolrot ersetzt und 24 Stunden später wurden die 96-Well-Platten mit IncuCyte ZOOM (Essen BioScience) abgebildet. Die Zellen wurden mit einem 10-fach-Objektiv unter Verwendung der Standardeinstellungen der IncuCyte-Software abgebildet, die zur Berechnung der Anzahl GFP-positiver Zellen aus vier 488-nm-Kanalbildern in jeder Vertiefung verwendet wurden (Daten für jeden Antikörper wurden in dreifacher Ausfertigung gesammelt). Die Anzahl der GFP-positiven Zellen wurde normalisiert und in einen Neutralisierungsprozentsatz umgerechnet. Pseudopartikel, die die Alpha-, Beta- und Delta-Spikes ausdrücken, wurden auf ähnliche Weise hergestellt und getestet (Ergänzungstabelle 1).

Alle Arbeiten mit SARS-CoV-2 wurden unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 3 an der University of California San Diego durchgeführt. SARS-CoV-2 isoliert WA1 (USA-WA1/2020, NR-52281), Beta (B.1.351, hCoV-19/Südafrika/KRISP-K005325/2020, NR-54009), Gamma (P.1, hCoV -19/Japan/TY7-503/2021, NR-54982) und Delta (B.1.617.2, hCoV-19/USA/PHC658/2021, NR-55611) wurden von BEI Resources erworben. Ursprünglich auf VeroE6 isolierte Virusbestände wurden einmal durch primäre menschliche Bronchialepithelzellen (NHBECs) passagiert, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) differenziert wurden, bevor sie auf VeroE6-TMPRSS2 (Sekisui XenoTech), hier als Vero-TMPRSS2 bezeichnet, expandiert wurden. Variante Alpha (B.1.1.7) wurde auf NHBECs bei ALI aus einem Nasopharyngealabstrich isoliert, der unter UCSD IRB #200477 erhalten wurde, und auf Vero-TMPRSS2 erweitert. Das Isolat wurde bei BEI Resources als hCoV-19/USA/CA_UCSD_5574/2020, NR-54020 hinterlegt. Die Variante Omicron (BA.1) wurde isoliert und auf Vero-TMPRSS2-Zellen aus einem Nasopharynxabstrich expandiert, der unter UCSD IRB #160524 mit der bei GISAID hinterlegten Sequenz (EPI_ISL_8186377) erhalten wurde. Alle Virusbestände wurden durch Tiefensequenzierung verifiziert.

Die Virustiter wurden mithilfe einer Kombination aus Fluoreszenzfokus-Assay und Gewebekultur-Infektionsdosis-Assays (TCID)50 auf Vero-TMPRSS2- und Calu-3-Monoschichten (ATCC) validiert. Reihenverdünnungen von Virusvorräten in DMEM (Corning, Nr. 10-014-CV) wurden zu Vero-TMPRSS2-Monoschichten in Platten mit 96 Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Für Fluoreszenzfokustests wurden die Zellen mit 1 % Carboxymethylcellulose in DMEM, ergänzt mit 2 % FBS und 1x Pen/Strep, überschichtet. Die Platten wurden je nach Assay 24 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert und dann mit einer Endkonzentration von 4,5 % Formaldehyd mindestens 30 Minuten lang bei RT fixiert. Für TCID50-Assays wurden Vero-TMPRSS2- oder Calu-3-Zellen wie oben infiziert und anschließend 100 µL DMEM oder MEM mit 2 % FBS pro Vertiefung hinzugefügt. Monoschichten wurden mindestens 4 Tage lang auf das Auftreten von CPE beobachtet und dann wie oben fixiert und mit Antikörper gegen SARS-CoV-2 Nucleocapsid (1 µg/ml) angefärbt. TCID50 wurde mit der Reed-Muench-Methode47,48,49 berechnet.

Für den viralen Nukleokapsidnachweis in Vero-TMPRSS2-Zellen durch Immunfluoreszenz wurden die Zellen zweimal mit PBS × 1 gewaschen und 30 Minuten bei RT in 4 % Formaldehyd fixiert. Fixierte Zellen wurden mit PBS × 1 gewaschen und für Immunfluoreszenz mit BD Cytofix/Cytoperm gemäß dem Protokoll des Herstellers für fixierte Zellen permeabilisiert und dann mit einem primären Nukleokapsid-Antikörper (1 µg/ml) (GeneTex GTX135357) auf SARS-CoV-2 gefärbt. und ein sekundärer Anti-Kaninchen-AF594-Antikörper (ThermoFisher, A11037). Die Kerne wurden mit 1 µM Sytox Green gegengefärbt. Infizierte Zellen aus Whole-Well-Scans wurden mit dem Incucyte S3 (Sartorius) identifiziert. Die Daten wurden von den Incucyte-Analysemodulen protokolliert und mit GraphPad Prism 8 grafisch dargestellt.

SARS-CoV-2 RBD (Reste Arg319 bis Lys529) wurde mithilfe des Bac-to-Bac-Baculovirus-Systems (Invitrogen) exprimiert. RBD, das das gp67-Signalpeptid und einen C-terminalen 6×His-Tag enthielt, wurde in pFastBac1 eingefügt, um das Plasmid pFastBac1-RBD zu bilden. Das Plasmid wurde dann in DH10-Bac-Komponentenzellen transformiert. Das rekombinante Bacmid wurde extrahiert und mit Cellfectin II (Invitrogen, Nr. 10362100) weiter in Sf9-Zellen transfiziert. Die rekombinanten Viren wurden aus dem transfizierten Überstand geerntet und amplifiziert, um einen Virusbestand mit hohem Titer zu erzeugen. Die Viren wurden dann verwendet, um Hi5-Zellen für die RBD-Expression zu infizieren. Im Überstand abgesondertes RBD wurde geerntet und auf Kobalt-Agarose-Kügelchen aufgetragen, dann mit 300 mM Imidazol eluiert und unter Verwendung einer Superdex 200-Erhöhungssäule 10/300 (GE Healthcare) in einem Puffer mit 20 mM HEPES bei pH 8,0 weiter gereinigt 150 mM NaCl.

Die schwere und leichte Kette von TAU-2303 oder TAU-2212 wurden getrennt in einen pCMV-Vektor kloniert und unter Verwendung von PEI im Verhältnis 1:1 vorübergehend in HEK293F-Zellen transfiziert. Der Überstand wurde 4 Tage nach der Transfektion geerntet. TAU-2212 wurde mithilfe von Protein-A-Perlen (GE Healthcare) eingefangen und gereinigt, mit 0,1 M Glycin bei pH 3,2 eluiert und dann auf pH 7,6 neutralisiert.

Zur Fab-Herstellung wurden die gereinigten Antikörper (TAU-2303 und TAU-2212) unter Verwendung der Protease Papain (Sigma, Nr. P3125) mit einem IgG-zu-Papain-Verhältnis von 66:1 (Gew./Gew.) 3 Stunden lang bei 37 °C verdaut C. Die Fc-Domäne und unverdaute Antikörper wurden mit Protein-A-Sepharose (GE Healthcare) entfernt und der Durchfluss gesammelt und unter Verwendung einer Superdex 200 Erhöhung 10/300-Säule (GE Healthcare) in einem Puffer mit 20 mM HEPES bei pH 8,0 weiter gereinigt und 150 mM NaCl.

Die extrazelluläre Domäne des S-Proteins (S-ECD) (1–1208 Aminosäuren, Genbank-ID: QHD43416.1) wurde mit sechs Prolinsubstitutionen an den Resten 817, 892, 899, 942, 986 und 987 in den pCMV-Vektor kloniert ( S6P-Mutante) oder zwei Prolin-Substitutionen an den Resten 967 und 968 (S2P-Mutante)50, eine „GSAS“-Substitution an den Resten 682 bis 685 und ein C-terminales T4-Fibritin-Trimerisierungsmotiv, gefolgt von einem StrepII-Tag (S6P-Mutante) oder einer Flagge Tag (S2P-Mutante). Die S2P- oder S6P-pCMV-Plasmide wurden zur vorübergehenden Transfektion von HEK293F-Zellen mit Polyethylenimin (PEI) (Polysciences, Nr. 24765) verwendet. Das rekombinante S6P wurde aus dem Zellüberstand unter Verwendung von StrepTactin-Harz (IBA) affinitätsgereinigt. Das eluierte Material wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer Superose 6 10/300-Säule (GE Healthcare), die in 20 mM HEPES pH 8,0 und 150 mM NaCl lief, weiter gereinigt. Der S2P enthaltende Überstand wurde 4 Tage nach der Transfektion gesammelt, S2P wurde durch Anti-Flag-Antikörperkügelchen affinitätsgereinigt und mit 0,1 mg/ml 3×Flag-Peptid in 20 mM HEPES bei pH 7,6 und 150 mM NaCl eluiert.

Der Fab-Anteil von TAU-2303 wurde mit RBD in einem Molverhältnis von 1:2 bei 4 °C gemischt und der resultierende Komplex wurde durch Größenausschlusschromatographie mit einer Superdex 200-Erhöhungssäule 10/300 in 150 mM NaCl gereinigt 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Die den Komplex enthaltenden Peakfraktionen wurden gesammelt und zur Kristallisation auf 6,5 mg/ml konzentriert. Die RBD-Fab2303-Kristalle wurden bei 18 °C unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit hängendem Tropfen mit 1 μl Protein, gemischt mit 1 μl Reservoirlösung, enthaltend 0,2 M Natriumtartrat-Dihydrat und 14 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 3350, gezüchtet. Die Kristalle wurden in der mit 15 % Glycerin ergänzten Reservoirlösung eingeweicht und zur Datenerfassung in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Der Fab-Anteil von TAU-2212 wurde zur Kristallisation auf 7 mg/ml konzentriert. Der Kristall wurde bei 16 °C in 26 % (w/v) Polyethylenglykol 3350, 0,2 M (NH4)2SO4, pH 8,0 gezüchtet. Die Kristalle wurden in der mit 10 % Glycerin ergänzten Reservoirlösung eingeweicht und zur Datenerfassung in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Die Röntgenbeugungsdaten wurden an den Strahllinien BL18U (RBD-Fab2303) und BL02U (Fab2212) der Shanghai Synchrotron Research Facility gesammelt. Die Wellenlänge betrug 0,980 Å und die Datenerfassungstemperatur 100 K. Die Daten wurden mit HKL200051 verarbeitet und skaliert. Die Struktur wurde durch molekularen Austausch mit PHASER52 bestimmt. Der manuelle Aufbau und die Anpassungen der Strukturen wurden in COOT53 durchgeführt. Die Struktur von RBD-Fab2303 wurde mithilfe von PHENIX54 verfeinert. Die Datenverarbeitung ergab, dass der Kristall von Fab2212 zur Raumgruppe P65 gehört. Allerdings scheint die meroedrische Zwillingsbildung den Kristall der Raumgruppe P6522 zuzuordnen. Die Struktur von Fab2212 wurde anhand der Zwillingsdaten unter Verwendung von Refmac555 mit dem Zwillingsoperator k, h, -l und einem geschätzten anfänglichen Zwillingsverhältnis von 0,52 bis 0,48 zwischen den beiden Domänen verfeinert. Das endgültige verfeinerte Zwillingsverhältnis zwischen den beiden Domänen betrug 0,60 bis 0,40. Die Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ramachandran-Statistiken lauten wie folgt: 97,24 % favorisiert und 2,76 % erlaubt für RBD-Fab2303; 95,26 % befürworteten, 4,5 % erlaubten und 0,24 % Ausreißer für Fab2212. Bei der Fab2212-Verfeinerung wurden Werte in den Spalten „Rwork/Rfree“ und „Rms-Abweichungen“ aus der refmac5-Jobausgabe ermittelt. Die Strukturanalyse von Antikörper-Antigen-Kontakten wurde mit CCP4i56 bewertet (Ergänzungstabellen 2,3). Alle Strukturdarstellungen wurden mithilfe von UCSF Chimera und ChimeraX57,58 erstellt.

Fab2303 wurde mit dem gereinigten S6P-Trimer (Molverhältnis Fab pro Protomer 2:1) gemischt, um den Fab-S-Komplex in einer Konzentration von 2 mg/ml zu bilden. Die Mischung wurde 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 3 μl der Mischung auf löchrige Glimmentladungskohlenstoffgitter (Quantifoil, Cu 200 Mesh, R1,2/1,3) aufgetragen. Das Gitter wurde 4,5 s lang bei 100 % Luftfeuchtigkeit abgetupft, bevor es in flüssigem Ethan unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) schockgefroren wurde. Für die Herstellung des TAU-2212-S2P-Komplexes wurden S2P und TAU-2212 30 Minuten lang auf Eis in einem Molverhältnis von 1:2 inkubiert. Der Antikörper-Spike-Komplex wurde durch Protein-A-Kügelchen gereinigt. Die neutralisierte Elution wurde durch Anti-Flag-Antikörperkügelchen weiter gereinigt. Der eluierte Komplex wurde 20 Minuten lang mit 0,125 % Glutaraldehyd vernetzt. Die vernetzte Probe wurde durch Größenausschlusschromatographie mit einer Superose 6 10/300-Säule gereinigt. Die Zielfraktion wurde gesammelt und für die CryoEM-Gittervorbereitung unter ähnlichen Bedingungen wie für S6P und Fab2303 auf 0,8 mg/ml konzentriert.

Bilddaten der S6P-Fab2303- und S2P-mAb-TAU2212-Komplexe wurden mit einem Titan Krios-Elektronenmikroskop (FEI Company) gesammelt, das mit einer bei 300 kV betriebenen Feldemissionskanone und einer Gatan K3 Summit-Kamera ausgestattet war. Bilder von S6P-Fab2303 wurden in einem Defokusbereich von –1,5 bis –2,8 μm und einer Pixelgröße von 1,25 Å aufgenommen. Es wurde eine Gesamtdosis von ~ 50 Elektronen pro Å2 verwendet. Für die Datenerfassung wurde SerialEM verwendet. Insgesamt wurden 2599 Filmstapel für S6P-Fab 2303 und 4675 Filmstapel für S2P-TAU2212 gesammelt. Die Bilder in jedem Filmstapel wurden mithilfe von Motion Cor259 ausgerichtet, summiert und zweifach gruppiert. Die CTF-Parameter der mikroskopischen Aufnahmen wurden von Gctf unter Berücksichtigung lokaler Defokusvariationen bestimmt60. Für den S6P-Fab2303-Komplex wurden mit Gautomatch insgesamt 546293 Partikel in Boxen eingeteilt und anschließend mit RELION61 einer 2D-Klassifizierung unterzogen. Die KryoEM-Struktur des SARS-CoV-2-Spikes im geschlossenen Zustand (PDB-Zugangsnummer: 6VXX62) wurde auf 40 Å tiefpassgefiltert und als Ausgangsmodell verwendet. Für die abschließende 3D-Verfeinerung wurden insgesamt 38331 Partikel ausgewählt, ohne jegliche Symmetrie vorzuschreiben, was eine KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 4,5 Å ergab (Tabelle 2).

Für den S2P-mAb-TAU2212-Komplex wurden Daten bei einer Defokussierung von −1,5 bis −2,0 µm und einer Pixelgröße von 0,97 Å gesammelt. 90569 Partikel wurden von Gautomatch ausgewählt und anschließend einer 2D-Klassifizierung mit RELION 3.0 unterzogen. Die 2D-Klassifizierungsergebnisse zeigten zwei Hauptklassen, eine mit einem einzelnen Spike und die andere mit zwei direkt miteinander verbundenen Spikes. Partikel in den beiden Klassen wurden für getrennte 3D-Klassifizierungen in RELION 3.0 aufgeteilt. Für die vernetzten Kopf-an-Kopf-Spikes wurden 39788 Partikel für die 3D-Verfeinerung mit auferlegter D3-Symmetrie ausgewählt, was zu einer KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 9,36 Å führte. Um die Rekonstruktion zu verbessern, wurden die Kopf-an-Kopf-Spike-Partikel in zwei Partikel mit jeweils einem Spike und drei gebundenen Fabs aufgeteilt. Die gespaltenen Partikel wurden lokalen Verfeinerungen unterzogen, was zu einer KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 7,3 Å führte. Die Auflösung der Karte mit einer von cryoSPARC erzeugten engen Maske wurde auf 6,1 Å verbessert (ergänzende Abbildung 6).

Partikel in Klassen mit einer einzelnen Spitze wurden von Gautomatch ausgewählt und einer 2D-Klassifizierung unterzogen. Ausgewählte Partikel wurden einer 3D-Klassifizierung mit einer S-Trimer-KryoEM-Karte als Referenz unterzogen (PDB-Zugangsnummer: 6XEY63). Dies führte zu vier unterschiedlichen Konformationen: Konformation 1 hat zwei gebundene Fabs; Konformation 2 hat nur ein gebundenes Fab; Konformation 3 hat zwei Fabs von einem mAb und ein Fab von dem anderen mAb; und Konformation 4 ist dreifach symmetrisch und hat drei gebundene Fabs. Partikel aus jeder Konformation wurden ausgewählt und zur Verfeinerung gegen einen RBD-„All-Down“-Spike verwendet, der auf 60 Å niedrig gehalten wurde. Für Konformation 4 wurden die letzten Verfeinerungen mit 72056 ausgewählten Partikeln und auferlegter C3-Symmetrie durchgeführt. Die Auflösung der endgültigen rekonstruierten Karte beträgt 3,5 Å. Wir haben die verfeinerten Halbkarten von Relion auf cryoSPARC zur Schätzung der lokalen Auflösung angewendet und mit der von cryoSPARC generierten automatisch verengten Maske und dem lokalen Filtertool wurde die Auflösung der nachbearbeiteten Karte auf 3,3 Å verbessert. Die Seitenkettendichten sind in den meisten rekonstruierten Karten deutlich sichtbar (ergänzende Abbildung 8). Für die Konformationen 1, 2 und 3 wurden die endgültigen Verfeinerungen mit 20.339, 15.868 bzw. 14.193 ausgewählten Partikeln und ohne Vorgabe einer Symmetrie durchgeführt. Die Verfeinerungen führten zu einer KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 5,5 Å für Konformation 1, einer KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 7,8 Å für Konformation 2 und einer KryoEM-Karte mit einer Auflösung von 6,5 Å für Konformation 3. Die Verarbeitung der KryoEM-Karte denn Konformation 1 entsprach laut cryoSPARC der Konformation 4 und die Auflösung wurde auf 4,7 Å verbessert. Um die Fab-Merkmale in den Konformationen 2 und 3 beizubehalten, verwendeten wir in den CryoSPARC-Lokalfilter-Jobs lockerere Masken und die endgültige Auflösung betrug 7,3 Å bzw. 6,4 Å.

Alle verfeinerten Dichtekarten wurden mit einem negativen B-Faktor angewendet und um die Modulationstransferfunktion (MTF) des Detektors korrigiert. Die gemeldete Auflösung basiert auf dem Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskriterium (FSC) 0,14364,65 (ergänzende Abbildung 7).

Alle Diagramme wurden mit den Prism-Versionen 8 und 9 erstellt und SD berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Atomkoordinaten und EM-Karten wurden in der Proteindatenbank (http://www.pdb.org) bzw. der EM-Datenbank hinterlegt: Fab2303-RBD-Komplex (PDB: 7WBZ), Fab2303-S-Komplex (EMD: 32411), Fab2212 (PDB: 7WC0), mAb2212-S-Komplex in Konformation 1 (EMD: 32416), Konformation 2 (EMD: 32417), Konformation 3 (EMD: 32418), Konformation 4 (EMD: 32421, PDB: 7WCD) , Konformation 5 mit Kopf-an-Kopf-Spikes (EMD: 32420) und Konformation 5 mit einzelner Spitze (EMD: 32419).

Garcia-Beltran, WF et al. Mehrere SARS-CoV-2-Varianten entgehen der Neutralisierung durch impfstoffinduzierte humorale Immunität. Zelle 184, 2523 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lucas, C. et al. Einfluss zirkulierender SARS-CoV-2-Varianten auf die durch mRNA-Impfstoffe induzierte Immunität. Natur https://doi.org/10.1038/s41586-021-04085-y (2021).

Bates, TA et al. Neutralisierung von SARS-CoV-2-Varianten durch Genesenen- und BNT162b2-Impfserum. Nat. Komm. 12, 5135 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brouwer, PJM et al. Starke neutralisierende Antikörper von COVID-19-Patienten definieren mehrere Angriffspunkte. Wissenschaft 369, 643–650 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreer, C. et al. Längsschnittisolierung potenter keimbahnneutralisierender SARS-CoV-2-Antikörper von COVID-19-Patienten. Zelle 182, 843–854 e812 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robbiani, DF et al. Konvergente Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-2 bei rekonvaleszenten Personen. Natur https://doi.org/10.1038/s41586-020-2456-9 (2020).

Rogers, TF et al. Isolierung wirksamer neutralisierender SARS-CoV-2-Antikörper und Schutz vor Krankheiten in einem Kleintiermodell. Wissenschaft https://doi.org/10.1126/science.abc7520 (2020).

Wec, AZ et al. Breite Neutralisierung SARS-bedingter Viren durch humane monoklonale Antikörper. Wissenschaft https://doi.org/10.1126/science.abc7424 (2020).

Mor, M. et al. Multiklonale SARS-CoV-2-Neutralisierung durch Antikörper, die aus Spendern mit schwerer COVID-19-Erkrankung isoliert wurden. PLoS Pathog. 17, e1009165 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hansen, J. et al. Studien an humanisierten Mäusen und rekonvaleszenten Menschen ergeben einen SARS-CoV-2-Antikörpercocktail. Wissenschaft 369, 1010–1014 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baum, A. et al. Ein Antikörpercocktail gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein verhindert die schnelle Mutationsflucht, die bei einzelnen Antikörpern beobachtet wird. Science 369, 1014–1018 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, P. et al. SARS-CoV-2 neutralisierender Antikörper LY-CoV555 bei ambulanten Patienten mit Covid-19. N. engl. J. Med. 384, 229–237 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, RE et al. Wirksamkeit monoklonaler Antikörper in vivo gegen SARS-CoV-2-Variantenstämme. Natur 596, 103–108 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, P. et al. Antikörperresistenz der SARS-CoV-2-Varianten B.1.351 und B.1.1.7. Natur 593, 130–135 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoffmann, M. et al. Die SARS-CoV-2-Varianten B.1.351 und P.1 entkommen neutralisierenden Antikörpern. Zelle 184, 2384–2393 e2312 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Copin, R. et al. Die monoklonale Antikörperkombination REGEN-COV schützt in präklinischen und menschlichen Studien vor dem Entweichen der SARS-CoV-2-Mutation. Zelle 184, 3949–3961 e3911 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rambaut, A. et al. Vorläufige genomische Charakterisierung einer neuen SARS-CoV-2-Linie im Vereinigten Königreich, die durch einen neuartigen Satz von Spike-Mutationen definiert wird. https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike- Mutationen/563 (2020).

Tegally, H. et al. Nachweis einer besorgniserregenden SARS-CoV-2-Variante in Südafrika. Natur 592, 438–443 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Faria, NR et al. Genomische Charakterisierung einer neu entstehenden SARS-CoV-2-Linie in Manaus: vorläufige Ergebnisse. J. Virol. https://doi.org/10.1128/JVI.00119-21 (2021).

Mlcochova, P. et al. Replikation der Delta-Variante von SARS-CoV-2 B.1.617.2 und Immunumgehung. Natur https://doi.org/10.1038/s41586-021-03944-y (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Edara, VV et al. Infektions- und impfstoffinduzierte neutralisierende Antikörperreaktionen auf die Varianten SARS-CoV-2 B.1.617. N. engl. J. Med. 385, 664–666 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Gowrisankar, A., Priyanka, TMC & Banerjee, S. Omicron: eine mysteriöse Variante der Besorgnis. EUR. Physik. J. 137, 100 (2022).

CAS Google Scholar

Deng, X. et al. Übertragung, Infektiosität und Neutralisierung einer Spike-L452R-SARS-CoV-2-Variante. Zelle 184, 3426–3437.e3428 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weisblum, Y. et al. Entkommen Sie neutralisierenden Antikörpern durch SARS-CoV-2-Spike-Protein-Varianten. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.61312 (2020).

Thomson, EC et al. Zirkulierende SARS-CoV-2-Spike-N439K-Varianten behalten ihre Fitness bei und umgehen gleichzeitig die Antikörper-vermittelte Immunität. Zelle 184, 1171–1187 e1120 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fonager, J. et al. Arbeitspapier zu SARS-CoV-2-Spike-Mutationen, die bei dänischen Nerzen auftreten, ihrer Ausbreitung auf den Menschen und Neutralisierungsdaten. https://files.ssi.dk/Mink-cluster-5-short-report_AFO2 (2020).

ECDC. Entdeckung neuer SARS-CoV-2-Varianten im Zusammenhang mit Nerz. https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA-SARS-CoV-2-in-mink-12-nov-2020.pdf (2020).

Li, Q. et al. Der Einfluss von Mutationen im SARS-CoV-2-Spike auf die virale Infektiosität und Antigenität. Zelle 182, 1284–1294 e1289 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mansbach, RA et al. Die SARS-CoV-2-Spike-Variante D614G bevorzugt einen offenen Konformationszustand. Wissenschaft. Adv. https://doi.org/10.1126/sciadv.abf3671 (2021).

Barnes, CO et al. Strukturen menschlicher Antikörper, die an SARS-CoV-2-Spikes gebunden sind, zeigen gemeinsame Epitope und wiederkehrende Merkmale von Antikörpern. Zelle https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.025 (2020).

Scheid, JF et al. B-Zell-Genomik hinter der Kreuzneutralisierung von SARS-CoV-2-Varianten und SARS-CoV. Zelle 184, 3205–3221.e3224 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mücksch, F. et al. Die Affinitätsreifung neutralisierender SARS-CoV-2-Antikörper verleiht Wirksamkeit, Breite und Widerstandsfähigkeit gegenüber viralen Escape-Mutationen. Immunität 54, 1853–1868.e1857 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potterton, L. et al. CCP4i2: die neue grafische Benutzeroberfläche der CCP4-Programmsuite. Acta Crystallogr D. Struktur. Biol. 74, 68–84 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Greaney, AJ et al. Kartierung von Mutationen im SARS-CoV-2-RBD, die der Bindung durch verschiedene Antikörperklassen entgehen. Nat. Komm. https://doi.org/10.1038/s41467-021-24435-8 (2021).

Alenquer, M. et al. Signaturen im SARS-CoV-2-Spike-Protein, die neutralisierenden Antikörpern die Flucht ermöglichen. PLoS Pathog. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009772 (2021).

Wang, LS et al. Ultrapotente Antikörper gegen diverse und hoch übertragbare SARS-CoV-2-Varianten. Wissenschaft 373, 759–75 (2021).

Google Scholar

Tortorici, MA et al. Hochwirksame menschliche Antikörper schützen über mehrere Mechanismen vor der SARS-CoV-2-Herausforderung. Wissenschaft 370, 950–957 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barnes, CO et al. SARS-CoV-2-neutralisierende Antikörperstrukturen beeinflussen therapeutische Strategien. Natur 588, 682–687 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hanke, L. et al. Ein bispezifischer Monomer-Nanokörper induziert Spike-Trimer-Dimere und neutralisiert SARS-CoV-2 in vivo. Nat. Komm. 13, 155 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dearlove, B. et al. Ein SARS-CoV-2-Impfstoffkandidat würde wahrscheinlich allen derzeit zirkulierenden Varianten entsprechen. P Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 23652–23662 (2020).

Artikel Google Scholar

Tao, KM et al. Die biologische und klinische Bedeutung neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten. Nat. Rev. Genet 22, 757–773 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boehm, E. et al. Neuartige SARS-CoV-2-Varianten: die Pandemien innerhalb der Pandemie. Klin. Microbiol Infec 27, 1109–1117 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Karim, SSA & Karim, QA Omicron SARS-CoV-2-Variante: ein neues Kapitel in der COVID-19-Pandemie. Lancet https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02758-6 (2021).

Chen, RTE et al. Resistenz von SARS-CoV-2-Varianten gegenüber der Neutralisierung durch monoklonale und aus Serum gewonnene polyklonale Antikörper. Nat. Med. https://doi.org/10.1038/s41591-021-01294-w (2021).

Starr, TN, Greaney, AJ, Dingens, AS & Bloom, JD Vollständige Karte der SARS-CoV-2-RBD-Mutationen, die dem monoklonalen Antikörper LY-CoV555 und seinem Cocktail mit LY-CoV016 entkommen. Zelle. Rep. Med. 2, ARTN 10025510.1016/j.xcrm.2021.100255 (2021).

Starr, TN et al. SARS-CoV-2-RBD-Antikörper, die die Breite und den Widerstand gegen Flucht maximieren. Natur 597, 97 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lei, C., Yang, J., Hu, J. & Sun, X. Zur Berechnung von TCID50 zur Quantifizierung der Virusinfektiosität. Virol. Sünde. 36, 141–144 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Burleson, FG, Chambers, TM & Wiedbrauk, DL Virologie: Ein Laborhandbuch. (Elsevier Science, 2014).

Reed, LJ & Muench, H. Eine einfache Methode zur Schätzung von Fünfzig-Prozent-Endpunkten. Bin. J. Epidemiol. 27, 493–497 (1938).

Artikel Google Scholar

Wrapp, D. et al. Kryo-EM-Struktur des 2019-nCoV-Spikes in der Präfusionskonformation. Wissenschaft 367, 1260–1263 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl. Kristalllogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 zur Verfeinerung makromolekularer Kristallstrukturen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 67, 355–367 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Collaborative Computational Project, N. Die CCP4-Suite: Programme für die Proteinkristallographie. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 50, 760–763 (1994).

Artikel Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: Moderne Herausforderungen in der Visualisierung und Analyse meistern. Proteinwissenschaft. 27, 14–25 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: Echtzeit-CTF-Bestimmung und -Korrektur. J. Struktur. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Neue Werkzeuge zur automatisierten hochauflösenden Kryo-EM-Strukturbestimmung in RELION-3. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.42166 (2018).

Walls, AC et al. Struktur, Funktion und Antigenität des SARS-CoV-2-Spike-Glykoproteins. Zelle 183, 1735 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, LH et al. Starke neutralisierende Antikörper gegen mehrere Epitope auf der SARS-CoV-2-Spitze. Natur 584, 450 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Heel, M. & Schatz, M. Fourier-Shell-Korrelationsschwellenwertkriterien. J. Struktur. Biol. 151, 250–262 (2005).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Scheres, SHW & Chen, SX Vermeidung von Überanpassung bei der Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 9, 853–854 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wardemann, H. et al. Vorwiegend Autoantikörperproduktion durch frühe menschliche B-Zell-Vorläufer. Wissenschaft 301, 1374–1377 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken den Mitgliedern der Xiang- und Freund-Labore für fruchtbare Diskussionen und Unterstützung. Wir danken Noam Ben-Shalom und dem Blavatnik Center for Drug Discovery an der Universität Tel Aviv für die Hilfe bei SPR-Messungen. NTF wird durch die ISF-Zuschussnummer Nr. 1422/18 finanziert. MGT und NTF werden durch KillCorona ISF-Zuschussnummer Nr. 3711/20 finanziert. YX wird vom Spring Breeze Fund der Tsinghua-Universität, der National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse: 31925023, 21827810, 31861143027), dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Zuschuss 2021YFA1300200) und dem Beijing Frontier Research Center for Biological Structure finanziert und das Beijing Advanced Innovation Center for Structure Biology. AFC wird durch ein NIH-Stipendium (K08 AI130381) und AFC durch einen Career Award for Medical Scientists des Burroughs Wellcome Fund unterstützt. MD wird durch das BARD-Stipendium Nr. IS-5270-20R und das ISF-Stipendium Nr. 401/18 finanziert. BAC wird durch ein Stipendium der United States-Israel Binational Science Foundation unterstützt. Das folgende Reagenz wurde von den Centers for Disease Control and Prevention hinterlegt und über BEI Resources, NIAID, NIH bezogen: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281. Das folgende Reagenz wurde von BEI Resources, NIAID, NIH bezogen: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/South Africa/KRISP-K005325/2020, NR-54009, bereitgestellt von Alex Sigal und Tulio de Oliveira. Das folgende Reagenz wurde von BEI Resources, NIAID, NIH bezogen: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (Brazil P.1), NR-54982, bereitgestellt vom National Institute of Infectious Diseases. Das folgende Reagenz wurde von BEI Resources, NIAID, NIH bezogen: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/USA/PHC658/2021 (Lineage B.1.617.2; Delta Variant), NR-55611, bereitgestellt von Dr. Richard Webby und Dr. Anami Patel. Wir danken Dr. Louise Laurent für die Bereitstellung der klinischen Probe B.1.1.7 zur Virusisolierung und dem UC San Diego Center for Advanced Laboratory Medicine Microbiology Laboratory für die Bereitstellung der klinischen Probe BA.1. Wir danken und UC San Diego EXCITE für die SARS-CoV-2-Genomsequenzierung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ruofan Li, Michael Mor, Bingting Ma.

Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology, Beijing Frontier Research Center for Biological Structure, Center for Infectious Disease Research, School of Medicine, Tsinghua University, Peking, China

Ruofan Li, Bingting Ma und Ye Xiang

Abteilung für Mikrobiologie und klinische Immunologie, Medizinische Fakultät, Universität Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Michael Mor & Natalia T. Freund

Medizinische Fakultät, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Alex E. Clark und Aaron F. Carlin

Das Labor für Strukturbiologie von Infektionskrankheiten, Azrieli-Fakultät für Medizin, Bar-Ilan-Universität, Tsafed, Israel

Joel Alter & Moshe Dessau

Labor für Molekulare Virologie, Azrieli-Fakultät für Medizin, Bar-Ilan-Universität, Tsafed, Israel

Michal Werbner & Meital Gal-Tanamy

Abteilung für Pädiatrie, School of Medicine, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

Jamie Casey Lee, Sandra L. Leibel und Ben A. Croker

Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, Kalifornien, USA

Sandra L. Leibel

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MM plante und führte die biochemischen Experimente durch, analysierte Daten, erstellte die Abbildungen und schrieb das Manuskript zusammen mit NTF, YX und BACRL, und BM führte die Kristall- und KryoEM-Strukturbestimmung und -Analyse durch, bereitete die Abbildungen vor und verfasste das Manuskript zusammen mit NTF. YX und BACMW, JA, MD und MGT führten die pseudoviralen Tests durch. JCL führte die Zelllinienpflege und den Plattenaufbau für BSL-3-Assays durch. AEC und AFC führten die Virusgenerierung und -titerierung durch. SLL und BAC haben BSL-3-Assays entworfen und durchgeführt. YX, NTF und BAC planten und überwachten die Experimente, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Ben A. Croker, Ye Xiang oder Natalia T. Freund.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Alle Autoren erfüllen die Autorenschaftskriterien und haben ihr Einverständnis gegeben, in diesem Manuskript als Autoren aufgeführt zu werden.

Communications Biology dankt Elisa Fadda, Alex Cohen und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Isabelle Lucet und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, R., Mor, M., Ma, B. et al. Konformationsflexibilität bei der Neutralisierung von SARS-CoV-2 durch natürlich hervorgerufene Anti-SARS-CoV-2-Antikörper. Commun Biol 5, 789 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03739-5

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Eingegangen: 17. Februar 2022

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 05. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03739-5

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