Nachricht

Jun 21, 2023

Phasenübergang und Umbau komplexer Baugruppen sind für SS18 wichtig

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2724 (2022) Diesen Artikel zitieren 2758 Zugriffe 4 Zitate 1 Altmetrische Metrikdetails Onkoprotein SS18-SSX ist ein Kennzeichen von Synovialsarkomen. Jedoch,

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2724 (2022) Diesen Artikel zitieren

2758 Zugriffe

4 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Onkoprotein SS18-SSX ist ein Kennzeichen von Synovialsarkomen. Als Teil des SS18-SSX-Fusionsproteins bleibt die Funktion von SS18 jedoch unklar. Hier stellen wir die Strukturen sowohl der menschlichen SS18/BRG1- als auch der Hefe-SNF11/SNF2-Subkomplexe dar. Beide Subkomplexe fügen sich zu Heterodimeren zusammen, die eine ähnliche Konformation aufweisen, was darauf hindeutet, dass SNF11 ein Homolog von SS18 in Chromatin-Remodelling-Komplexen sein könnte. Wichtig ist, dass unsere Studie zeigt, dass die Selbstassoziation der intrinsisch ungeordneten Region, der QPGY-Domäne, zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) von SS18 oder SS18-SSX und der anschließenden Rekrutierung von BRG1 in phasengetrennte Kondensate führt. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die Tyrosinreste in der QPGY-Domäne eine entscheidende Rolle bei der LLPS von SS18 oder SS18-SSX spielen. Störungen der SS18-SSX-LLPS oder der Bindung von SS18-SSX an BRG1 beeinträchtigen die NIH3T3-Zelltransformation durch SS18-SSX. Unsere Daten zeigen, dass sowohl LLPS als auch der Zusammenbau zu Chromatin-Remodelern zur onkogenen Aktivität von SS18-SSX bei Synovialsarkomen beitragen.

Das Synovialsarkom (SyS) ist eine bösartige Neubildung, die 10–20 % aller Weichteiltumoren ausmacht und bei jungen Erwachsenen eine schlechte Prognose hat1. Das charakteristische genetische Merkmal von SyS ist die wiederkehrende und spezifische chromosomale Translokation, t(X;18)(p11.2;q11.2), bei der das SS18-Gen auf Chromosom 18 mit einem der drei eng verwandten Gene auf dem Chromosom fusioniert wird X-Chromosom, SSX1, SSX2 und selten SSX42,3,4, was zu einem In-Frame-Fusionsgen SS18-SSX führt. Diese bemerkenswerte Translokation kommt bei praktisch 100 % der Synovialsarkome vor und ist oft die einzige zytogenetische Aberration1. Im Gegensatz zu herkömmlichen Translokationen bei anderen Weichteilsarkomen fehlt dem Onkofusionsprotein SS18-SSX eine DNA-Bindungsdomäne und es wird angenommen, dass es seine Aktivität durch Kombination mit anderen Chromatin-Modifikatoren ausübt5.

Der ATP-abhängige Chromatin-Remodelling-Komplex BAF, auch bekannt als Säugetier-SWI/SNF-Komplex, ist ein Remodeler mit mehreren Untereinheiten und von entscheidender Bedeutung für die Regulierung der Genexpression und der Entwicklungsprogrammierung. Die Fehlregulation des BAF-Komplexes führt zu neurologischen Störungen und bösartigen Erkrankungen des Menschen6. Darüber hinaus ist SS18 als Teil der SS18-SSX-Chimäre eine integrale Untereinheit des kanonischen BAF-Komplexes (CBAF), indem es durch Wechselwirkung mit der katalytischen Untereinheit BRG1 oder BRM7,8,9,10 an den CBAF-Komplex bindet. Die kürzlich erhaltene Architektur des menschlichen CBAF-Komplexes hat einige strukturelle Informationen über den komplexen Aufbau und die Chromatin-Remodellierung geliefert, allerdings sind die strukturellen Informationen über SS18 im zusammengesetzten CBAF-Komplex begrenzt11,12. Insbesondere ist es für SyS spezifisch, dass die Konkurrenz zwischen SS18 und SS18-SSX um den Zusammenbau innerhalb des CBAF-Komplexes zu einem biochemisch abweichenden Komplex führt und dadurch die Genexpression stört13,14.

Es wurde berichtet, dass die Deletion der N-terminalen 181 Aminosäuren des Onkoproteins SS18-SSX1 zum Verlust seiner transformierenden Aktivität führt15. Diese Beobachtung, zusammen mit den Ergebnissen, die zeigen, dass eine Überexpression von SS18 oder SSX allein keine Tumoren erzeugt, deutet darauf hin, dass beide Partner von SS18-SSX eine wichtige Rolle bei der Synovialsarkomagenese spielen13,15. Darüber hinaus weist SS18 oder SS18-SSX eine Sequenzdomäne mit geringer Komplexität (LCD) auf, die reich an Glutamin, Prolin, Glycin und Tyrosin ist (die QPGY-Domäne) und für die Transkriptionsaktivität wichtig ist15,16. Es wurde insbesondere berichtet, dass die intrinsisch ungeordneten LCDs der Onkofusionsproteinfamilie FUS/EWS/TAF15 (FET) die Bildung dynamischer Proteinkondensate durch einen physikalischen Prozess beinhalten, der als Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) bekannt ist und die Gentranskription steuert17,18,19 . Insgesamt ist es von großer Bedeutung, die Rolle von SS18 bei der Onkofusion SS18-SSX1 durch seine Bindung an den CBAF-Komplex oder die QPGY-Domäne beim Auftreten und der Entwicklung von SyS zu testen. In dieser Studie berichten wir über die Kristallstrukturen des menschlichen SS18/BRG1-Heterodimers, das aus dem CBAF-Komplex von Säugetieren stammt, und des Hefe-SNF11/SNF2-Heterodimers, das aus dem SWI/SNF-Komplex von S. cerevisiae stammt, mit einer Auflösung von 2,39 bzw. 2,15 Å. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die LCD von SS18 oder SS18-SSX (QPGY-Domäne) durch Tyrosinreste-vermittelte Selbstassoziation zu LLPS führen kann. Unsere Studie legt nahe, dass die Phasentrennung von SS18-SSX und die Bindung von SS18-SSX an den Chromatin-Remodelling-Komplex für die Transformationsaktivität des Onkoproteins SS18-SSX wichtig sind.

Das SS18-SSX1-Onkofusionsprotein wird durch Ersetzen der acht extremen carboxylterminalen Reste von SS18 (aa 379–387) durch ein carboxylterminales 78-Reste-Fragment von SSX1 (aa 111–188) erzeugt (Abb. 1a). Es wurde berichtet, dass entweder SS18 oder SS18-SSX1 an die N-terminale Region der ATPase-Untereinheit BRG1 oder BRM des Chromatin-Remodelling-Komplexes binden können9,10. Allerdings bleiben die Strukturinformationen der SS18-Bindung an den Remodellierungskomplex in den berichteten Strukturen begrenzt11,12. Dementsprechend haben wir zunächst die Wechselwirkung zwischen einem N-terminalen 282-Reste-Fragment von BRG1 (aa 1–282, Brg1(1-282)) und SS18, hier BRG1(1-282)/SS18 genannt, („/“ bezeichnet) bestätigt Proteinkomplexe mit getrennten Ketten und ähnlichen Strukturen im Folgenden), indem gezeigt wird, dass die beiden Proteine ​​aus einer Größenausschlusssäule koeluiert werden (ergänzende Abbildung 1a). Als nächstes kartierten wir jede Bindungsregion von BRG1 und SS18 mithilfe einer auf Trunkierung basierenden Methode in Kombination mit Größenausschlusschromatographie (ergänzende Abbildung 1b – d). Bemerkenswert ist, dass BRG1 (172-213) und SS18 (14-101) in einer analytischen Größenausschlusssäule zu einem Komplex zusammengefügt wurden (schwarze Linie in ergänzender Abbildung 1c und SDS-PAGE in ergänzender Abbildung 1d). Die analytische Ultrazentrifugation bestätigte außerdem, dass der BRG1(172-213)/SS18(14-101)-Komplex ein Heterodimer mit einer Stöchiometrie von 1:1 und einer Molekülmasse von 14,7 kDa bildet (schwarze Linie in der ergänzenden Abbildung 1f). Aufgrund dieser Ergebnisse kamen wir zu dem Schluss, dass der BRG1/SS18- oder BRG1/SS18-SSX1-Subkomplex durch die Wechselwirkung zwischen den Fragmenten BRG1(172–213) und SS18(14–101) ein Heterodimer bildet.

a Schematische Darstellung von SS18, SSX1, SS18-SSX1 und BRG1 in voller Länge. Das Onkoprotein SS18-SSX1 umfasst 457 Aminosäuren und bewahrt die Amino-terminalen 379 Aminosäuren von SS18 sowie die Carboxy-terminalen 78 Aminosäuren von SSX1. Die zur Strukturbestimmung verwendeten Proteinfragmente des SS18(14–101)/BRG1(172–213)-Komplexes sind durch einen Zwei-Wege-Pfeil gekennzeichnet und jeweils in Cyan und Magenta gefärbt. Das schematische Diagramm in der Einfügung zeigt die Mutante SS18(3M)-SSX1, die drei Aminosäuren I32, L54 und A65 enthielt, die in der SNH-Domäne zu Glutaminsäure mutiert waren, und die Mutante SS18(Y19S)-SSX1, die 19 Tyrosin enthielt Reste, die in der QPGY-Domäne zu Serin mutiert sind. b Cartoon-Darstellung des SS18(14-101) (Cyan)/BRG1(172-213) (Magenta)-Komplexes von der Seite und von unten gesehen. Die N- und C-Termini der beiden Proteine ​​sind markiert. PDB-Eintragscode: 7VRB. c–e Ligplot-Diagramme im schwarzen Rahmen zeigen hydrophobe Wechselwirkungen zwischen SS18 und BRG1. Drei Gruppen hydrophober Kerne sind in (c–e) jeweils als Speichenbögen dargestellt. f Co-IP-Experimente, die die Interaktion zwischen SS18-Wildtyp (WT) oder der Mutante SS18(3M) und BRG1 testen. Die Mutante SS18(3M) enthält drei Aminosäuremutationen I32E, L54E und A65E. Extrakte wurden aus HEK293T-Zellen hergestellt, die wie angegeben mit Kombinationen von Plasmiden transfiziert wurden. Das untere Feld zeigt 3 % des Myc-Brg1 als Eingabe für jede IP.

Um zu verstehen, wie BRG1 und SS18 oder SS18-SSX1 aneinander binden, haben wir versucht, die Kristallstruktur des Heterodimers BRG1(172-213)/SS18(14-101) zu bestimmen. Es gelang uns, Kristalle des einzelnen Polypeptids zu erhalten, das durch die Fusion von BRG1 (172–213) an den N-Terminus von SS18 (14–101) mit einem durch das Tabakätzvirus (TEV) spaltbaren Segment entstand. Das gereinigte Einzelketten-Fusionsprotein von BRG1(172–213) und SS18(14–101), hierin als BRG1(172–213)-SS18(14–101) bezeichnet, („-“ bezeichnet Proteine ​​in einer Einzelkettenfusion , ähnliche Strukturen im Folgenden) wurde als einzelner Peak aus einer analytischen Größenausschlusssäule (rote Linie in ergänzender Abbildung 1c und SDS-PAGE in ergänzender Abbildung 1e) eluiert und zu einem Heterodimer mit einer Molekülmasse von 15,8 kDa zusammengesetzt Experiment zur Sedimentationsgeschwindigkeit (SV) (rote Linie in der ergänzenden Abbildung 1f). Die Kristallstruktur von BRG1(172-213)-SS18(14-101) wurde mit einer Auflösung von 2,39 Å mit vier Kopien des komplexen Moleküls in einer asymmetrischen Einheit bestimmt (Ergänzungstabelle 1). Im endgültigen Modell wurde BRG1 (172–213) von AA 172 bis 207 aufgelöst, einschließlich der QLQ-Domäne (Abb. 1b und ergänzende Abb. 2). SS18 (14-101) war von AA 14 bis 79, einschließlich der SNH-Domäne, gut aufgelöst (Abb. 1b und ergänzende Abb. 3). Die Gesamtstruktur von BRG1(172-213)-SS18(14-101) ähnelt einem Vier-Helix-Bündel, das die Reste 174–190 (αA), 198–205 (αB) in BRG1(172-213) und die Reste 19 umfasst –39 (α1), 44–74 (α2) in SS18 (14-101) (Abb. 1b und ergänzende Abb. 2 und 3). Die Wechselwirkung zwischen BRG1(172-213) und SS18(14-101) wurde durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen aufrechterhalten. Die hydrophoben Aminosäuren (I32, L54 und A65) auf SS18 und die Aminosäuren an den entsprechenden Positionen von BRG1 bilden drei Gruppen hydrophober Kerne (Abb. 1c – e).

Um die in der Struktur des BRG1(172-213)-SS18(14-101)-Komplexes beobachteten Wechselwirkungen zu validieren, führten wir eine Reihe von Mutagenesestudien durch. Die Reste A65, L54 und I32 wurden in SS18 oder SS18-SSX1 zu Glutaminsäure mutiert, hierin als SS18(3M) bzw. SS18(3M)-SSX1 bezeichnet (Abb. 1c – e). Wie erwartet zeigten Co-Immunpräzipitationsanalysen (Co-IP), dass die 3M-Mutationen in SS18 oder SS18-SSX1 die Bindung von SS18 (Spur 3 im Vergleich zu Spur 2 in Abb. 1f) oder SS18-SSX1 (Spur 4 im Vergleich) weitgehend stören können zu Spur 2 in der ergänzenden Abbildung 4a) zu BRG1. Wir verwendeten Zirkulardichroismus, um ein ähnliches Verhalten zwischen Wildtyp (WT) und mutiertem SS18(14-101) zu bestätigen, was sicherstellte, dass ein Verlust der BRG1-Bindungsaktivität nicht auf eine verringerte Stabilität des SS18(14-101)-Proteins zurückzuführen war (ergänzende Abbildung). 1g). Darüber hinaus wurden gemäß den Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen zwischen BRG1 (172–213) und SS18 (14–101) die Reste Q176 und Q183 von BRG1 durch Alanin ersetzt (ergänzende Abbildung 1h). Bemerkenswerterweise hoben entweder die doppelten (Q176A, Q183A) oder die einzelnen Mutationen (Q183A) die Bindung von BRG1 an SS18 fast vollständig auf (ergänzende Abbildung 1i). Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse den durch die Struktur von BRG1(172-213)-SS18(14-101) aufgedeckten Interaktionsmodus.

Frühere Studien haben über Strukturen des Hefe-SWI/SNF-Komplexes berichtet20,21. Es liegen jedoch nur begrenzte Strukturinformationen zu SNF11 vor, da es ein unverzichtbarer Bestandteil des Komplexes ist22. Gemäß der Sequenzausrichtung stellten wir fest, dass das Hefe-SNF11 in der SNH-Domäne von menschlichem SS18, die an der Bindung an die QLQ-Domäne von BRG1 beteiligt ist, stark konserviert war (Abb. 1 und ergänzende Abb. 3). Diese Beobachtung legt zusammen mit der Sequenzausrichtung, die zeigt, dass die QLQ-Domänen von BRG1 und SNF2, dem Hefe-Homolog von BRG1, hoch konserviert sind, nahe, dass sich SNF11 durch Bindung an die QLQ-Domäne von SNF2 zum SWI/SNF-Komplex zusammenfügen könnte (ergänzende Abb. 2). Daher exprimierten wir SNF11 und ein Fragment mit 60 Resten, einschließlich der QLQ-Domäne von SNF2 (aa 248–308, SNF2(248–308)), und bestätigten, dass SNF11 und SNF2(248–308) wie angegeben zu einem heteromeren Komplex zusammengefügt wurden durch ihre Koelution aus einer analytischen Größenausschlusssäule (ergänzende Abbildung 5a). Als nächstes kartierten wir die SNF2-Bindungsregion auf SNF11 einem Fragment mit 132 Resten (aa 38-169, SNF11 (38-169); Abb. 2a und ergänzende Abb. 5b). Die analytische Ultrazentrifugation bestätigte außerdem, dass der SNF11(38-169)/SNF2(248-308)-Komplex ein Heterodimer mit einer Stöchiometrie von 1:1 und einer Molekülmasse von 20,0 kDa bildete (ergänzende Abbildung 5c). Aufgrund dieser Ergebnisse kamen wir zu dem Schluss, dass sich die SNF11-Untereinheit zum SWI/SNF-Komplex zusammenfügt, indem sie durch die Wechselwirkung zwischen den Fragmenten SNF11 (38–169) und SNF2 (248–308) ein Heterodimer bildet.

a Schematische Darstellung von SNF11 und SNF2 in voller Länge. Die zur Strukturbestimmung verwendeten Proteinfragmente des SNF11(38-169)/SNF2(248-308)-Komplexes sind durch einen Zwei-Wege-Pfeil gekennzeichnet und orange bzw. grün gefärbt. b Cartoon-Darstellung des SNF11(38-169) (orange)/SNF2(248-308) (grün)-Komplexes von der Seite und von unten gesehen. Die N- und C-Termini der beiden Proteine ​​sind markiert. PDB-Eintragscode: 7VRC. c Das Ligplot-Diagramm im schwarzen Rahmen zeigt Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen SNF11 und SNF2. Wasserstoffbrückenbindungen werden als schwarze gepunktete Linien dargestellt. Die Zahlen über den Linien stellen den Abstand dar und die Einheit ist Å. Schwarze durchgezogene Punkte stellen Kohlenstoffatome dar, blaue durchgezogene Punkte stellen Stickstoffatome dar und rote durchgezogene Punkte stellen Sauerstoffatome dar. d Co-IP-Experimente, die die Interaktion zwischen SNF2-Wildtyp (WT) oder dem mutierten SNF2 und SNF11 testen. Extrakte wurden aus HEK293T-Zellen hergestellt, die wie angegeben mit Kombinationen von Plasmiden transfiziert wurden. Das untere Feld zeigt 3 % des Myc-SNF2 als Eingabe für jede IP.

Um das Bindungsmodell von SNF11 und SNF2 aufzudecken, haben wir die Kristallstruktur des SNF11(38-169)/SNF2(248–308)-Komplexes mit einer Auflösung von 2,15 Å bestimmt, mit zwei Kopien des komplexen Moleküls in einer asymmetrischen Einheit ( Ergänzungstabelle 1). Im endgültigen Modell waren alle Reste sichtbar, mit Ausnahme der Reste 38–54 von SNF11 (38–169) und der Reste 298–308 von SNF2 (248–308). Die Überlagerung der Strukturen der Hefe-SNF11(38-169)/SNF2(248-308)- und menschlichen BRG1(172-213)-SS18(14-101)-Heterodimere zeigte, dass die menschlichen SS18/BRG1- und Hefe-SNF11/SNF2-Subkomplexe ähnliche Heterodimere aufweisen Montagemodell (ergänzende Abbildung 5d). Die Gesamtstruktur von SNF11(38–169)/SNF2(248–308) ähnelt einem Sechs-Helix-Bündel, in dem SNF2(248–308) aus drei α-Helices besteht [Reste 251–267 (αA'), 274 –285 (αB') und 289–296 (αC')] und SNF11(38–169) besteht ebenfalls aus drei α-Helices [Reste 61–94 (α1'), 99–130 (α2') und 155–168 (α3')] (Abb. 2b und ergänzende Abbildungen 2 und 3). Die Bindung von SNF11 an SNF2 wurde hauptsächlich durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen mehreren Aminosäurepaaren vermittelt, darunter die Bindung von Q63SNF11 an Q252SNF2 und die individuelle Bindung von L70SNF11, N73SNF11 oder S74SNF11 an Q259SNF2 (Abb. 2c). Darüber hinaus sind die SNF2-Reste Q252 und Q259 von der Hefe bis zum Menschen konserviert (ergänzende Abbildung 2). Um die Wechselwirkungen zwischen SNF2 und SNF11 in der Heterodimerstruktur zu validieren, wurden die Reste Q252 und Q259 durch Alanin ersetzt. Wie erwartet zeigte die Co-IP-Analyse, dass die Einzelmutation Q259A die Bindung von SNF2 an SNF11 dramatisch schwächt (Spur 3 im Vergleich zu Spur 2 in Abb. 2d) und dass die Doppelmutationen Q252A und Q259A die Interaktion zwischen SNF2 und SNF11 vollständig aufheben ( Spur 4 im Vergleich zu Spur 2 in Abb. 2d). Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse den Interaktionsmodus zwischen SNF2 und SNF11, der durch die Struktur des SNF11(38-169)/SNF2(248-308)-Heterodimers offenbart wurde.

Wie bereits erwähnt, zeigten unsere strukturellen und biochemischen Studien, dass die Bindungen von menschlichem SS18 oder Onkofusions-SS18-SSX1 an BRG1 und Hefe-SNF11 an SNF2 einen ähnlichen Montagemodus aufweisen. Im Vergleich zu SNF11 enthält SS18 eine zusätzliche Carboxylregion, einschließlich der QPGY-Domäne (Abb. 1a und 2a und ergänzende Abb. 3). Interessanterweise zeigte eine IUPred-Analyse, dass auch die Carboxylregion von SS18 intrinsisch ungeordnet ist23 (Abb. 3a). Aus diesen Daten und den Beobachtungen, die zeigen, dass die QPGY-Domäne reich an Tyrosinresten ist, die an multivalenten Wechselwirkungen zum Antrieb von Protein-LLPS beteiligt sind, folgerten wir, dass SS18 in vitro und in vivo Kondensate bilden könnte18,24. Wie erwartet bildete gereinigtes fluoreszenzmarkiertes SS18-Protein (Alexa488-SS18) spontan mikrometergroße Tröpfchen im Tröpfchenbildungspuffer. Die Anzahl und Größe der Tröpfchen nahm abhängig von der Proteinkonzentration zu, ein charakteristisches Phänomen von LLPS (Abb. 3b). Darüber hinaus wurde die Bildung kondensierter Tröpfchen weitgehend unterdrückt, wenn der Lösung 5 % 1,6-Hexandiol zugesetzt wurde, was darauf hindeutet, dass hydrophobe Wechselwirkungen an dem Prozess beteiligt sind. Das 1,6-Hexandiol ist ein aliphatisches Molekül, von dem berichtet wird, dass es die durch hydrophobe Wechselwirkung induzierten Phasentrennungsanordnungen sowohl in vitro als auch in vivo stört25,26,27. Nachfolgende lichtmikroskopische Analysen ergaben, dass kugelförmige SS18-Tröpfchen auch dynamische Fusionsereignisse durchlaufen, was auf dynamische, flüssigkeitsähnliche Eigenschaften hinweist (Abb. 3c). Während der Proteinreinigung haben wir festgestellt, dass unterschiedliche Lagerungsbedingungen des Proteins, wie z. B. die Temperatur, dazu führen können, dass die SS18-Proteinlösungen opaleszierend werden. Wir trennten daher die kondensierte flüssige Phase durch Zentrifugation von den wässrigen Massenlösungen und stellten fest, dass LLPS von SS18 in einem weiten Temperaturbereich (4–37 °C getestet) auftreten kann28. Niedrigere Temperaturen können den Phasenübergang von SS18 fördern (Abb. 3d, e).

a Analyse der SS18-387-Aminosäureproteinsequenz. Bekannte Domänen SNH und QPGY. Die rote Linie sagt die Bewertung intrinsisch unstrukturierter Regionen (IUPred) für intrinsisch ungeordnete Tendenzen voraus; >0,5 gilt als ungeordnet. b Fluoreszenz- und Hellfeldbilder der SS18-Tröpfchen bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen. 1,6-Hexandiol (Hex, 5 %) wurde dem SS18-Protein (60 µM) zugesetzt, um die Tröpfchenbildung zu unterbrechen. Flüssigkeitströpfchen sind mit Alexa Fluor 488-markiertem SS18 angereichert (1:100 Molverhältnis von markiertem zu unmarkiertem SS18). Dieses Proteinmarkierungsverhältnis wurde während der gesamten Studie verwendet, sofern nicht anders angegeben. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. c Die kleinen Tröpfchen durchliefen bei Raumtemperatur eine zeitabhängige dynamische Fusion in dem Puffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl. Repräsentative SDS-PAGE-Analyse (d) und Quantifizierungsdaten e, die die Verteilung von Proteinen zwischen wässriger Lösung/Überstand (S) und kondensierten Flüssigkeitströpfchen/Pellet-Fraktionen (P) für SS18-Protein (30 µM) bei verschiedenen Temperaturen zeigen. Die Bandenintensitäten von Proteinen wurden mit der Software Image J v1.8.0 quantifiziert. Quantitative Daten stellen Ergebnisse aus drei unabhängigen Chargen von Sedimentationsexperimenten dar und werden als Mittelwert ± SEM aufgetragen. f Live-Cell-Imaging (GFP) und gleichzeitige Phasenkontrast-Bildgebung für GFP-SS18 und GFP-SNF11 in HEK293T-Zellen. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. g Repräsentative Zeitraffer-FRAP-Bilder, die zeigen, dass sich das GFP-SS18-Signal innerhalb der Puncta in HeLa-Zellen innerhalb weniger Sekunden erholte. Rote Kästchen zeigen die vergrößerten Bereiche. h FRAP-Erholungskurven für sechs GFP-SS18-Punkte aus unabhängigen sechs HeLa-Zellen mit Fehlerbalken, die den Mittelwert ± SEM angeben. Zeit 0 bezieht sich auf den Zeitpunkt des Photobleichimpulses.

Um zu testen, ob SS18 in lebenden Zelllinien LLPS durchlaufen kann, wurde exogenes GFP-markiertes SS18 (GFP-SS18) vorübergehend in HEK293T-Zellen exprimiert. Bemerkenswerterweise zeigte GFP-SS18 ein charakteristisches punktförmiges Muster in den Kernen mit Herden mit einer Größe von 0,2 bis 1 µm, was mit den Beobachtungen in früheren Studien übereinstimmt29,30. Im Gegensatz dazu ist GFP-markiertes SNF11 (GFP-SNF11), dem intrinsisch ungeordnete Regionen fehlen, diffus in der gesamten Zelle verteilt (Abb. 3f und ergänzende Abb. 6a). Darüber hinaus zeigten Experimente zur Fluoreszenzsignalwiederherstellung nach dem Bleichen (FRAP) in HeLa-Zellen, dass etwa 72,8 % der GFP-SS18-Moleküle in den Brennpunkten mit ihren Gegenstücken im umgebenden Volumenlösungsmittel ausgetauscht wurden, mit einer durchschnittlichen Erholungshalbwertszeit von 6,9 s (Abb. 3g, h). Dieses Ergebnis zeigte, dass SS18 in flüssigkeitsähnlichen Phasentröpfchen kondensiert ist, die als Puncta in Zellen gebildet werden. Zusammengenommen bildete SS18 in vitro phasengetrennte Tröpfchen und in vivo dynamische flüssigkeitsähnliche Kondensate.

Die QPGY-Domäne von SS18 besteht überwiegend aus Glutamin, Prolin und Glycin, wobei Tyrosinreste in unterschiedlichen Abständen vorkommen und Homo-Oligomere bilden9. In Anbetracht der aufkommenden Rolle der multivalenten Wechselwirkungen zwischen Tyrosinresten in Protein-LLPS haben wir 21 Tyrosinreste in der intrinsisch ungeordneten Region von SS18, hier als SS18 (Y21S) bezeichnet, zu Serin mutiert, um die Multimerisierung von SS18 zu stören (ergänzende Abbildung 3). )18,24. Wie erwartet zeigte die Co-IP-Analyse, dass die Mutante SS18(Y21S) ihre Fähigkeit zur Selbstassoziation verliert (Spur 4 im Vergleich zu Spur 2 in Abb. 4a). Im Vergleich zum Wildtyp-SS18-Protein (SS18-WT) zeigten die Sedimentationsexperimente, dass alle mutierten Proteine ​​​​SS18 (Y21S) nach der Zentrifugation im wässrigen Überstand verbleiben (Spuren 5 und 6 im Vergleich zu Spuren 1 und 2 in Abb. 4b). , C). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung zeigten gereinigte SS18(Y21S)-Proteine ​​eine diffuse Verteilung in HEK293T-Zellen und konnten keine Tröpfchen bilden (Abb. 4d, e). Um die Wirkung von Tyrosinresten bei der Phasentrennung weiter zu untersuchen, wurde die QPGY-Domäne von SS18 mit dem Carboxylterminal von SNF11 fusioniert, und diese Chimäre wurde SNF11-QPGY genannt. Die ergänzenden Abbildungen 5e, f liefern mehrere Beweislinien, die zeigen, dass die SNF11-QPGY-Chimäre möglicherweise auch eine Phasentrennung über die QPGY-Domänen-vermittelte Selbstassoziation erfährt. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch Tyrosinreste vermittelte Multimerisierung für die SS18-Phasentrennung wichtig ist.

ein Co-IP-Experiment, das die Selbstassoziationsfähigkeit von SS18 oder seinen Mutanten testet. Extrakte wurden aus HEK293T-Zellen hergestellt, die wie angegeben mit Kombinationen von Plasmiden transfiziert wurden. Das untere Feld zeigt 3 % des Myc-SS18 als Eingabe für jede IP. Repräsentative SDS-PAGE-Analyse (b) und quantitative Daten (c) für den Sedimentationstest von SS18 WT, Mutanten oder verschiedenen SS18/BRG1(1-282)-Mischungen, wie angegeben. Die Konzentration jedes Proteins beträgt 60 µM. Die Bandenintensitäten von Proteinen wurden mit der Software Image J v1.8.0 quantifiziert. Die statistischen Daten stellen Ergebnisse aus drei unabhängigen Chargen von Sedimentationsexperimenten dar und werden als Mittelwert ± SEM aufgetragen. d Fluoreszenz- und Hellfeldbilder von SS18 WT oder mutierten Tröpfchen bei einer Proteinkonzentration von 60 µM. Flüssigkeitströpfchen sind mit Alexa Fluor 488-markiertem SS18 WT oder Mutanten angereichert. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. e Repräsentative Fluoreszenzbilder von GFP-SS18(WT), GFP-SS18(Y21S) und GFP-SS18(3M) in HEK293T-Zellen. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. f Co-Lokalisierung von GFP-SS18-WT oder Mutanten und Cherry-BRG1 in HEK293T-Zellen. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. g Repräsentative Fluoreszenz- und Hellfeldbilder der Mischung aus Alexa Fluor 488-markiertem SS18 oder Mutanten (60 µM) und Cy3-markiertem BRG1(1-282) (60 µM) im Puffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl bei Raumtemperatur. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an.

Als katalytische Untereinheit mehrerer Chromatin-Remodelling-Komplexe bindet BRG1 spezifisch an die SNH-Domäne von SS18, wie bereits in Abb. 1 dargestellt. Daher folgerten wir, dass nukleare SS18-Kondensate BRG1 kompartimentieren könnten. Um diese Hypothese zu testen, exprimierten wir GFP-SS18 zusammen mit mCherry-markiertem BRG1 (Cherry-BRG1) in HEK293T-Zellen. Wie erwartet stellten wir fest, dass BRG1 bei Koexpression mit SS18 leicht in SS18-Kernkondensaten rekrutiert wird, bei Abwesenheit von SS18 jedoch eine diffuse Verteilung im Kern zeigt (Abb. 4f). Interessanterweise wurde BRG1 bei Coexpression mit der Mutante SS18(3M) vollständig von den Konzentraten abgetrennt (Abb. 4f). Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen überein, die zeigen, dass die Mutante SS18 (3M) nicht an BRG1 binden kann, wie zuvor in Abb. 1d gezeigt, aber zu LLPS fähig ist (Abb. 4b – e). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass BRG1 diffus mit der Mutante SS18 (Y21S) kolokalisiert, die die Unfähigkeit von LLPS aufweist, aber dennoch in der Lage ist, an BRG1 zu binden (Abb. 4f). Wir haben durchweg festgestellt, dass BRG1(1-282) in den SS18-WT-Kondensaten angereichert oder mit SS18-WT pelletiert ist, während die Mutante SS18(3M) weder BRG1(1-282) in die Tröpfchen rekrutieren noch BRG1(1) pelletieren kann -282) (Abb. 4b, c, g). Die Mutante SS18(Y21S) wurde als Kontrolle verwendet, da sie weder Tröpfchen bilden noch sich selbst und BRG1(1-282) pelletieren konnte. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Phasentrennung von SS18 durch die spezifische Wechselwirkung zwischen SS18 und BRG1 zur Anreicherung von BRG1 zu Kernkondensaten führt.

Wie bereits erwähnt, enthält das Onkofusionsprotein SS18-SSX1 fast die gesamte QPGY-Domäne von SS18 und behält die Fähigkeit, sich durch die Bindung der SNH-Domäne an BRG1 stabil in den CBAF-Komplex einzubauen (Abb. 1 und ergänzende Abb. 4a)13. Darüber hinaus kann die Repressionsdomäne (RD-Domäne) von SSX1 Transkriptionsregulatoren gezielt für bestimmte Genomorte rekrutieren14,31. Eine IUPred-Analyse ergab, dass die Carboxylregion, einschließlich der Domänen QPGY und RD, von SS18-SSX1 ebenfalls intrinsisch ungeordnet ist (ergänzende Abbildung 6b). Aufgrund dieser Beobachtungen möchten wir testen, ob SS18-SSX1 noch die Fähigkeit zur Phasentrennung behält und es von SS18 unterscheiden, das in normalen Geweben und Zellen weit verbreitet ist. Erstens stellten wir fest, dass die gereinigten SS18-SSX1-Fusionsproteine ​​in den gleichen Lösungszusammensetzungen und Proteinkonzentrationen wie SS18 keine kondensierten Tröpfchen bilden. Interessanterweise stellten wir fest, dass die SS18-SSX1-Lösung trübe wird und dass die Tröpfchenbildung konzentrationsabhängig erfolgt, wenn der Puffer 10 % Ficoll enthält, was die überfüllte Umgebung des Kerns nachahmt (Abb. 5a). Darüber hinaus verschmelzen kleine Tröpfchen innerhalb der ersten 15 s allmählich zu größeren (Abb. 5b). Wir beobachteten auch, dass in Gegenwart von 10 % Ficoll etwa 40 % der SS18-SSX1-Proteine ​​aus der kondensierten Phase (Pelletfraktionen) gewonnen wurden (Spuren 7 und 8 in Abb. 5c, d). In Kombination mit 10 % Ficoll führt 1,6-Hexandiol (5 % Hex) zur Dispersion der kondensierten Phase (Spuren 13 und 14 im Vergleich zu Spuren 7 und 8 in Abb. 5c, d). Wir fanden jedoch heraus, dass gereinigtes SSX1 (111-188) selbst unter den gleichen Bedingungen wie das SS18-SSX1-Protein keine LLPS durchlaufen kann (ergänzende Abbildung 6c). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass das Onkofusionsprotein SS18-SSX1 in vitro in Gegenwart von Crowding-Reagenzien einer LLPS unterliegt.

a Repräsentative Fluoreszenzbilder des Fusionsproteins SS18-SSX1 bei verschiedenen Proteinkonzentrationen. Flüssigkeitströpfchen sind mit Alexa Fluor 488-markiertem SS18-SSX1 angereichert. Der Tröpfchenbildungspuffer besteht aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 10 % Ficoll. Die Maßstabsbalken zeigen 10 µm an. b Phasenkontrastbildgebung des SS18-SSX1-Proteins zu verschiedenen Zeitpunkten, um die dynamische Fusion zweier Tröpfchen zu zeigen. Repräsentative SDS-PAGE-Analyse (c) und quantitative Daten (d) des Sedimentationstests von SS18-SSX1-Protein oder Mutanten im Puffer mit oder ohne 10 % Ficoll. 1,6-Hexandiol (Hex, 5 %) wurde dem SS18-SSX1-Protein zugesetzt, um die Tröpfchenbildung zu unterbrechen. Die Konzentration jedes Proteins beträgt 60 µM. Die Bandenintensitäten von Proteinen wurden mit der Software Image J v1.8.0 quantifiziert. Die statistischen Daten stellen Ergebnisse aus drei unabhängigen Chargen von Sedimentationsexperimenten dar und wurden als Mittelwert ± SEM aufgetragen. e Repräsentative Fluoreszenz- und Hellfeldbilder der Mischung aus Alexa Fluor 488-markiertem SS18-SSX1 oder Mutanten (60 µM) und Cy3-markiertem BRG1(1-282) (60 µM) im Puffer mit 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 10 % Ficoll bei Raumtemperatur. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. f Live-Cell-Bildgebung für GFP-SS18-SSX1, GFP-SS18(3M)-SSX1 und GFP-SS18(Y19S)-SSX1 in HEK293T- und HS-SY-II-Zellen. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. g FRAP-Erholungskurven für GFP-SS18-SSX1-, GFP-SS18(3M)-SSX1- und GFP-SS18(Y19S)-SSX1-Punkte aus drei unabhängigen HeLa-Zellen mit Fehlerbalken, die den Mittelwert ± SEM angeben. Zeit 0 bezieht sich auf den Zeitpunkt des Photobleichimpulses. h Koexpression von GFP-SS18-SSX1 oder Mutanten und Cherry-BRG1 in HEK293T- und HS-SY-II-Zellen. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an.

Als nächstes versuchten wir, die Fähigkeit der Phasentrennung zweier Mutanten SS18(3M)-SSX1 und SS18(Y19S)-SSX1 zu testen, die drei Mutationen (I32E, L54E und A65E) und 19 Tyrosinreste enthielten, die in SS18 zu Serin mutiert waren , bzw. (Abb. 1a und ergänzende Abb. 3). Wie erwartet wurde eine ähnliche Menge der mutierten SS18(3M)-SSX1- und SS18-SSX1-WT-Proteine ​​aus der kondensierten Phase gewonnen (Spuren 9 und 10 im Vergleich zu Spuren 7 und 8 in Abb. 5c, d). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Co-IP-Analysen in der ergänzenden Abbildung 4b überein, was darauf hinweist, dass die Mutanten SS18(3M)-SSX1 und SS18-SSX1-WT zur Selbstassoziation fähig sind (ergänzende Abbildung 4b). Darüber hinaus erholte sich die Mutante SS18(Y19S)-SSX1 nicht aus der kondensierten Phase, was ein weiterer Beweis dafür ist, dass durch Tyrosinreste vermittelte multivalente Wechselwirkungen der QPGY-Domäne von SS18 die treibende Kraft für die LLPS von SS18-SSX1 sind (Spuren 11 und 12). in Abb. 5c, d). Es ist auch wichtig zu beachten, dass nur der Wildtyp SS18-SSX1 in der Lage ist, BRG1(1-282) in die kondensierten Tröpfchen zu rekrutieren (Abb. 5e). Obwohl die Mutante SS18(Y19S)-SSX1 die Fähigkeit besaß, an BRG1 zu binden, konnte sie keine kondensierten Tröpfchen bilden, wohingegen die Mutante SS18(3M)-SSX1 in der Lage war, kondensierte Tröpfchen zu bilden, jedoch kein BRG1 zu rekrutieren (Abb. 5e). ). Anschließend beobachteten wir, dass sowohl SS18-SSX1 als auch die Mutante SS18(3M)-SSX1 im Vergleich zu SS18-SSX1 und der Mutante SS18(3M)-SSX1 einen dichteren puncta-ähnlichen Cluster aufweisen, der in den Zellen HEK293T und der Synovialsarkom-Zelllinie HS-SY-II oder CME-1 verteilt ist SS18-Puncta, zuvor in Abb. 4e dargestellt (Abb. 5f und ergänzende Abb. 4c). Im Gegensatz dazu diffundierte die Mutante SS18 (Y19S) -SSX1 in diese Zellen und es wurde eine geringe Proteinaggregation beobachtet (Abb. 5f und ergänzende Abb. 4c). Um die Eigenschaften des Puncta-Clusters detailliert zu beschreiben, verwendeten wir FRAP, um die Austauschrate von SS18-SSX1 oder zwei mutierten Molekülen im Puncta-Cluster mit ihren Gegenstücken im umgebenden Massenlösungsmittel zu überwachen. Nach dem Bleichen wurden etwa 54–58 % des GFP-SS18-SSX1- und GFP-SS18(3M)-SSX1-Puncta-Signals innerhalb einer durchschnittlichen Halbwertszeit von 38,7 s bzw. 49,8 s wiederhergestellt, was langsamer ist als die von SS18 (Abb. 3h und 5g). Bemerkenswerterweise erholten sich etwa 76 % der GFP-SS18(Y19S)-SSX1-Fluoreszenz im Cluster in einer durchschnittlichen Halbwertszeit von 28,2 s, was darauf hinweist, dass die Mutationen von Tyrosin zu Serin in der QPGY-Domäne zu dynamischeren Eigenschaften führen Mutante (Abb. 5g). Die Mutante SS18(3M)-SSX1 bewies, dass sie nicht in der Lage ist, mit BRG1 zu kolokalisieren, wohingegen SS18-SSX1-WT in der Lage war, BRG1 in die phasengetrennten Kondensate in den Zellen HEK293T und der Synovialsarkom-Zelllinie HS-SY-II oder CME-1 zu rekrutieren (Abb. 5h und ergänzende Abb. 4d). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Mutante SS18 (Y19S) -SSX1, die keine Phasentrennung durchführen kann, auch in den Zelllinien eine diffuse Verteilung von BRG1 aufweist (Abb. 5h und ergänzende Abb. 4d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Onkofusion SS18-SSX1 BRG1 durch spezifische Wechselwirkungen zwischen SS18-SSX1 und BRG1 in phasengetrennte Kondensate rekrutiert.

Als nächstes wollten wir die Rolle der SS18-SSX1-Phasentrennung und der BRG1-Bindung bei der SyS-Entwicklung untersuchen. Um dieses Problem anzugehen, haben wir drei NIH3T3-Fibroblastenzelllinien rekonstituiert, die SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1 und SS18(Y19S)-SSX1 stabil überexprimieren. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die Expressionsniveaus von SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1 und SS18(Y19S)-SSX1 in jeder Zelllinie vergleichbar waren und im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht waren (Abb. 6a). Um die Rolle von SS18-SSX1 bei der Tumorentstehung zu testen, führten wir EdU-Zellproliferations- und klonogene Tests durch, um die DNA-Synthese und die Fähigkeit zur Klonbildung festzustellen. Bemerkenswerterweise zeigten EdU-Proliferationsexperimente, dass im Vergleich zur Kontrolle die Überexpression von WT SS18-SSX1 die Proliferation von NIH3T3-Zellen effizient fördert, wohingegen beide Mutanten SS18(3M)-SSX1 und SS18(Y19S)-SSX1 teilweise einen Mangel bei der Förderung der Zellproliferation aufweisen (Abb . 6b, c). Experimente zur Koloniebildung ergaben, dass NIH3T3-Zellen, die entweder die Mutanten SS18(3M)-SSX1 oder die Mutanten SS18(Y19S)-SSX1 exprimieren, im Vergleich zum Wildtyp wenige und kleinere Klone bilden (Abb. 6d). Darüber hinaus testeten wir die Migrations- und Invasionsfähigkeiten von NIH3T3-Zellen, die WT SS18-SSX1 sowie Mutanten stabil exprimierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass WT SS18-SSX1, nicht jedoch die Mutanten, sowohl die Migration als auch die Invasion von NIH3T3-Zellen fördern (Abb. 6e – h). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Phasentrennung des Onkoproteins SS18-SSX1 und sein Zusammenbau zu Chromatin-Remodelling-Komplexen für seine Transformationsaktivität in der Fibroblastenzelle NIH3T3 wichtig sind.

a Der Proteingehalt von SS18-SSX1 WT oder in NIH3T3-Zellen überexprimierten Mutanten. b EdU-Assay von NIH3T3-Zelllinien, die SS18-SSX1 WT oder Mutanten überexprimieren. EdU-positive Kerne (mit Alexa Fluor 488-Azid markiert; grün) und 1× Hoechst-gefärbte Kerne aller Zellen (blau) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. c Statistisches Diagramm des EdU-Assays in (b). Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SEM, einfaktorielle ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichstest; n = 5 unabhängige Experimente, ****P < 0,0001. d Plattenkoloniebildung von NIH3T3-Zelllinien, die SS18-SSX1 WT und Mutanten überexprimieren. Die Kolonien wurden mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Zellmigration (e) und Invasions-g-Assay von NIH3T3-Zelllinien, die SS18-SSX1 WT und Mutanten überexprimieren. Die Zellen wurden mit 1 % Kristallviolett gefärbt und durch Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht. f, h Statistisches Diagramm des Zellmigrations- und Invasionstests. Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SEM, einfaktorielle ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichstest; n = 3 unabhängige Experimente, ****P < 0,0001.

In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass menschliches SS18 an BRG1 und Hefe-SNF11 an SNF2, das Hefe-Homolog von BRG1, mit einer ähnlichen Heterodimerstruktur bindet (Abb. 1b und 2b sowie ergänzende Abb. 5d). Dies weist auf die Konservierung zwischen SNF11 und der N-terminalen SNH-Domäne von SS18 hin. Aufgrund dieser Beobachtung und der Sequenzähnlichkeiten von SNF11 und der SNH-Domäne von SS18 über ein breites Artenspektrum hinweg können wir den Schluss ziehen, dass SNF11 möglicherweise ein Homolog von SS18 in S. cerevisiae ist (ergänzende Abbildung 3). SS18 verfügt über eine zusätzliche intrinsisch ungeordnete Region, einschließlich der QPGY-Domäne, die LLPS durch multivalente hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt, während sein Hefe-Homolog SNF11 nicht über die Fähigkeit zur Phasentrennung verfügt (Abb. 3). Darüber hinaus zeigte die Chimäre SNF11-QPGY auch eine Phasentrennung (ergänzende Abbildung 5e, f). Vor diesem Hintergrund haben wir vermutet, dass SS18 die Eigenschaft der Phasentrennung erworben hat, um im Laufe der Evolution an bestimmten physiologischen Funktionen in Chordata teilzunehmen. Interessanterweise zeigte eine aktuelle Studie, dass SS18 die CBAF-Assemblierung durch Phasentrennung vermittelt, um den Übergang von pluripotent zu somatisch zu regulieren, was mit unseren Spekulationen übereinstimmt32. In ihrer Studie fanden die Autoren heraus, dass eine C-terminale intrinsisch ungeordnete Region von SS18 die Bildung mikroskopischer Kondensate unter der Bedingung einer ektopischen Überexpression reguliert und dass die N-terminalen 70aa von SS18 für seine Bindung an CBAF erforderlich sind. Diese Beobachtungen stimmen mit unseren Ergebnissen überein. Darüber hinaus verwendeten wir gereinigte rekombinante Proteine, um SS18-LLPS in vitro zu bestätigen und die strukturellen Grundlagen der Wechselwirkung zwischen SS18 und BRG1 aufzudecken.

Wir haben die Phasentrennung von SS18 oder SS18-SSX1 in lebenden Zellen mithilfe ektopischer Überexpressionssysteme untersucht (Abb. 3–5). Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass das endogene SS18 oder SS18-SSX1 eine ähnliche puncta-ähnliche Verteilung in embryonalen Stamm- oder Synovialsarkomzellen der Maus aufweist wie die Überexpression in HeLa, HEK293T oder Synovialsarkomzellen 30, 32 (Abb. 3–5). ). Es ist jedoch unbestreitbar, dass LLPS ein konzentrationsabhängiger Prozess ist. Obwohl es schwierig ist, LLPS in nativen Zustandssystemen zu bewerten33, sind zukünftige Studien erforderlich, um SS18- oder SS18-SSX1-LLPS in einem geeigneten In-vivo-System zu validieren.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Eigenschaften der von SS18 und SS18-SSX1 gebildeten Tröpfchen/Kondensate leicht unterschiedlich sind, obwohl die treibende Kraft für die LLPS ähnlich ist (Abb. 3–5). Insbesondere kann SS18-SSX1 im Vergleich zu SS18 nur in Gegenwart einer bestimmten Konzentration an Crowding-Reagenz phasengetrennte Tröpfchen bilden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass SS18-SSX1-Fluoreszenzmoleküle mit ihren Gegenstücken im Massenlösungsmittel viel langsamer austauschen als SS18 (Abb. 3 und 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Fusionspartner SSX1 (111-188) zur LLPS der Onkofusion SS18-SSX1 beitragen oder diese regulieren könnte. Es wurde auch berichtet, dass SSX-Proteine ​​zusammen mit einigen Kernpunkten diffus in den Kernen von SyS- oder Fibrosarkomzellen verteilt sind34,35. Unsere Ergebnisse zeigten übereinstimmend, dass gereinigtes SSX1 (111-188) selbst in vitro nicht in der Phasentrennung auftreten kann (ergänzende Abbildung 6c). Aus diesem Grund muss der genaue Mechanismus des SSX1(111-188) bei der Regulierung der Phasentrennung von SS18-SSX1 und seine zugrunde liegende biologische Bedeutung noch weiter untersucht werden.

Es wird angenommen, dass die Fehlregulation chromatinbasierter Genregulationssysteme ein zentraler Treiber der SyS-Pathogenese ist36. Eine frühere Studie wies auf eine interessante Fähigkeit von SS18-SSX hin, das den Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) für ATF2-Zielgene rekrutiert, um Tumorsuppressorgene zu unterdrücken, die vom CDKN2A-Locus kodiert werden37. Andererseits deuten andere Studien darauf hin, dass SS18-SSX die BAF-Genomverteilung und die Subtypniveaus verändert und daher die Fähigkeit des Komplexes erhöht, die PRC2-Funktion zu stören. Diese Störung könnte die Aktivierung der Genexpression durch die COMPASS-Familie der Histon-H3K4-Methylasen vermitteln und abweichende onkogene Transkriptionsprogramme orchestrieren13,38,39. Eine Studie von Banito et al. fanden heraus, dass SS18-SSX-Fusionen mit KDM2B-PRC1.1, einem nichtkanonischen Polycomb-Repressionskomplex 1, assoziieren, um Transkriptionsfaktoren, die Ziele der Polycomb-vermittelten Genrepression sind, abnormal zu aktivieren40. Nachfolgende Untersuchungen ergaben, dass die SS18-SSX-spezifische Konformation von BAF-Komplexen eine starke Präferenz für H2AUbK119-markierte Nukleosomen aufweist, was ihre Präferenz für mit Polycomb dekorierte Chromatinregionen unterstützt31. Diese Beobachtungen legen zusammen mit unseren Ergebnissen nahe, dass die Phasentrennung ein wichtiger Mechanismus ist. Dieser Mechanismus ermöglicht es SS18-SSX1-Kondensaten, als Knotenpunkte bei der Kompartimentierung von Chromatin-Remodelling-Komplexen auf effiziente und spezifische Weise zu fungieren, die die synoviale Sarkomagenese vorantreiben. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die Wirkung und Rolle von SS18-SSX LLPS in einem Tiermodell genauer zu untersuchen.

Die gezielte Behandlung einer Reihe von Krankheiten auf LLPS-bezogene Mechanismen auszurichten, ist eine vielversprechende Idee41. Beispielsweise wurde ein niedermolekularer Inhibitor der nuklearen PARP-1/2-Aktivität zur Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) entwickelt, indem er die Bildung von zytoplasmatischen TDP-43-Aggregaten in Säugetierzellen reduziert42. In Anbetracht unserer Ergebnisse und dieser früheren Studien könnten kleine Moleküle, die auf die Phasentrennung von SS18-SSX1 abzielen, eine attraktive Therapieform für SyS sein.

Humanes SS18 (Reste 1–387, SS18(1–387)), Hefe-SNF11 (Reste 1–169, SNF11(1–169)) und Hefe-SNF2 (Reste 248–308, SNF2(248–308)) wurden amplifiziert durch PCR aus der cDNA-Bibliothek der HEK293T-Zelllinie bzw. der Genom-DNA von Saccharomyces cerevisiae. Humanes BRG1 wurde von Addgene erworben (Plasmid Nr. 1959). SSX1 und SS18 (Y21S) wurden durch Gensynthese (GENEWIZ) erhalten. Mutationen wurden mithilfe einer Standard-PCR-basierten Mutagenesemethode erzeugt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Um ein einkettiges Fusionsprotein aus BRG1 (172–213) und SS18 (14–101) herzustellen, wurden DNA-Fragmente durch PCR amplifiziert und mit einem durch TEV-Protease spaltbaren Segment (Glu–Asn–Leu–Tyr–Phe–) verknüpft. Gln–Ser). Auf beiden Seiten des TEV-Segments wurden zwei Aminosäuren (Ser-Gly) eingefügt. Anschließend wurde die Einzelkette in eine firmenintern modifizierte Version des pET32a-Vektors (Novagen, 69015-3CN) kloniert und das resultierende Protein enthielt einen Thioredoxin (Trx)-his6-Tag an seinem N-Terminus. SNF11 (38–169) und SNF2 (248–308) wurden getrennt und nacheinander in zwei Mehrfachklonierungsstellen des pETDuet-1-Vektors (Novagen, 71146-3) kloniert. Für in der Phasentrennung untersuchte Proteine: SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1, SS18(Y19S)-SSX1 und BRG1(1-282) wurden in eine firmenintern modifizierte Version des pET32a-Vektors kloniert. Die resultierenden Proteine ​​enthielten einen Trx-his6-Tag am N-Terminus. SS18, SS18(3M) und SS18(Y21S) wurden in eine firmenintern modifizierte Version des pET32a-Vektors mit einem Maltose-bindenden Protein (MBP)-his6-Tag am N-Terminus kloniert (Ergänzungstabelle 2).

BL21(DE3) Codon Plus Escherichia coli-Zellen, die das Expressionsplasmid enthielten, wurden in LB-Medium bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600 0,6 erreichte, und die Proteinexpression wurde mit 300 μM Isopropyl-β-d-thiogalactosid (Chemsynlab, A04283) bei 16 induziert °C für 16–18 Stunden. Das Se-Met-substituierte Protein wurde in Methionin-auxotrophen E. coli B834 (DE3)-Zellen exprimiert, die in LeMaster-Medium gezüchtet wurden. Die Proteine ​​wurden durch Ni2+-NTA-Agarose-Affinitätschromatographie und anschließende Größenausschlusschromatographie auf einem HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) in 50 mM MES pH 6,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM DTT gereinigt. Nach der Verdauung mit PreScission Protease zur Abspaltung des N-terminalen Trx-his6-Tags wurde das Zielprotein auf einer HiTrap SP HP-Anionenaustauschsäule weiter gereinigt. Der letzte Reinigungsschritt war Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex 200 10/300-Anstiegssäule (GE Healthcare) in 50 mM MES pH 6,0, 100 mM NaCl und 1 mM DTT.

SV-Experimente wurden in einer analytischen Ultrazentrifuge Beckman Coulter XL-I (Beckman Coulter) unter Verwendung von Doppelsektor-Mittelstücken und Saphirfenstern durchgeführt. Die Proteine ​​wurden vor den Experimenten mit einer Superdex 200 10/300-Anstiegssäule in den Puffer umgewandelt, der 50 mM MES pH 6,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM DTT enthielt. SV-Experimente wurden bei 4 °C unter Verwendung von Interferenzlichtdetektion durchgeführt. Die SV-Daten wurden mit dem Programm SEDFIT v14.043,44 analysiert.

Sowohl native als auch Se-Met-substituierte Kristalle des menschlichen BRG1(172-213)-SS18(14-101)-Komplexes wurden durch die Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen bei 20 °C erhalten. Kristalle wurden in der Lösung gezüchtet, die 1,16 M monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat und 0,24 M dibasisches Kaliumphosphat bei einer Proteinkonzentration von 40 mg/ml enthielt. Native Kristalle des Hefe-SNF11(38-169)/SNF2(248-308)-Komplexes wurden bei 20 °C und einer Proteinkonzentration von 7 mg/ml unter Verwendung der gleichen Methode wie oben gezüchtet. Das Protein wurde gegen eine Reservoirlösung aus 0,79 M einbasigem Natriumphosphat-Monohydrat und 0,61 M zweibasigem Kaliumphosphat äquilibriert. Um Phaseninformationen zu erhalten, wurden die Kristalle von SNF11(38-169)/SNF2(248-308) 30 Minuten lang in 2 mM Quecksilber(II)-acetat (Hampton, HR2-446) eingeweicht. Alle Kristalle wurden in der Fällungsmittellösung mit 25 % (v/v) Glycerin unter Verwendung von flüssigem Stickstoff kryogekühlt und alle Beugungsdaten wurden in der Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) an den Strahllinien BL19U145 gesammelt und mit dem Softwarepaket HKL2000 v714 verarbeitet46.

Die Phasenlage und der anfängliche Modellaufbau der menschlichen komplexen Kristallstruktur BRG1(172-213)-SS18(14-101) wurden durch anomale Dispersion bei einer Wellenlänge (SAD) unter Verwendung des PHENIX v1.15-2155 AutoSol-Assistenten47 bzw. AutoBuild-Assistenten48 bestimmt. Die Anfangsphasen und Modelle des Hefe-SNF11(38-169)/SNF2(248-308)-Komplexes wurden von SAD unter Verwendung des Shelx C/D/E-Programms49 in CCP4i v7.0.073 bestimmt. Anschließend wurden die ursprünglichen Modelle mit dem Programm Coot v0.8.350 weiter umgebaut und manuell angepasst und mit dem Verfeinerungsprogramm Phenix v1.15-2155 (https://www.phenix-online.org/) verfeinert. Das endgültige Modell wurde mit MolProbity51 weiter validiert. Detaillierte Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Alle Strukturfiguren wurden mit PyMOL v1.6 (http://www.pymol.org/) erstellt und das planare Diagramm der Protein-Protein-Wechselwirkung wurde mit Ligplot+ v2 erstellt. 2 Software52.

HEK293T-Zellen (CBTCCCAS, GNHu17), HeLa-Zellen (CBTCCCAS, TCHu187), NIH3T3-Zellen (CBTCCCAS, SCSP-515) und HS-SY-II-Zellen (von Hiroshi Sonobe, Abteilung für Pathologie, Kochi Medical School, Nankoku, Japan) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Sigma-Aldrich, D6429), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Biological Industries, 04-010-1 A), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Hyclone, SV30010), gelagert in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C. CME-1-Zellen (von Nicolo Riggi, Abteilung für experimentelle Pathologie, Institut für Pathologie, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois und Universität Lausanne, Lausanne, Schweiz) wurden in RPM1 1640 kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum und Penicillin-Streptomycin enthielt. Die Plasmide wurden mit Polyethylenimin (Polysciences, 02371-500) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Für Plasmide, die an stabilen Überexpressionszelllinien beteiligt sind, wurden die Wildtyp-SS18-SSX1- und mutierten Gene in den Expressionsvektor pSIN-EF2-Pur (Addgene, Plasmid Nr. 16579) mit einem N-terminalen Myc-Tag, genannt pSIN-, subkloniert. EF2-SS18-SSX1, pSIN-EF2-SS18(3M)-SSX1 und pSIN-EF2-SS18(Y19S)-SSX1 (Ergänzungstabelle 2). Zur Herstellung lentiviraler Partikel wurden ein rekombinanter Vektor zusammen mit dem pSPAX2-Verpackungsvektor und dem virusexprimierenden Hüllvektor PMD2.G in HEK293T-Zellen transfiziert. NIH3T3-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und am folgenden Tag mit verschiedenen Viren infiziert, und 10 µg/ml Polybrene (Sigma-Aldrich, H9268) wurden hinzugefügt, um die Infektionseffizienz zu erhöhen. Nach 48-stündiger Infektion wurde ein frisches Medium mit 1,5 µg/ml Puromycin (Solarbio, P8230) zum Screening positiver Klone verwendet. Positive Klone wurden ausgewählt, um die stabile Expression des leeren Vektors SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1 oder SS18(Y19S)-SSX1 durch die Zelllinien zu etablieren. Die Ladungskontrollproteine ​​in jeder Zelllinie wurden durch Western Blot mit HRP-konjugiertem GAPDH-Antikörper (Proteintech, HRP-60004) mit einer Verdünnung von 1:10.000 untersucht.

HEK293T-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmidkombinationen transfiziert. Nach 24-stündiger Transfektion wurden HEK293T-Zellen unter Verwendung von eiskaltem Zelllysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 8 % Glycerin, 0,5 % NP40, 0,5 % Triton X-100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid usw.) lysiert Protease-Inhibitor-Cocktails) und durch 20-minütige Zentrifugation bei 11.750 × g und 4 °C geklärt. Die Überstände wurden dann mit Agarose-konjugierten Anti-GFP-Antikörpern 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die Agarosekügelchen wurden dreimal mit Zelllysepuffer gewaschen und mit SDS-Probenpuffer eluiert. Anschließend wurden die Proben einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unterzogen.

Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Millipore, IPVH00010) übertragen. Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang mit 10 % fettfreier Milch in TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20) blockiert. Die PVDF-Membranen wurden mit 1:5000 verdünntem Anti-Myc-Antikörper (Sigma-Aldrich, M4439) und 1:5000 verdünntem Anti-GFP-Antikörper (Sigma-Aldrich, G1544) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur immungeblottet und dann mit Ziegen-Anti sondiert -Maus-IgG-HRP (Santa Cruz, SC-2005) oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Santa Cruz, SC-2004) mit einer Verdünnung von jeweils 1:5000 und entwickelt mit einem chemilumineszierenden Substrat (Millipore, WBKLS0500) . Proteinbanden wurden auf dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem Tanon-5200 (Tanon Science and Technology) sichtbar gemacht.

Gereinigtes SS18- und BRG1(1-282)-Protein wurden in Puffer hergestellt, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 150 mM NaCl enthielt. SS18-SSX1-Protein wurde im Tröpfchenbildungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 10 % Ficoll) auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Die Bildung einer Phasentrennung wurde entweder direkt durch bildgebende Verfahren oder durch Sedimentationsexperimente28 untersucht. Die Beobachtung und Charakterisierung der Tröpfchen erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (LEICA CTR5000) und die Daten wurden mit der Software Leica Application Suite v4.4.0 erfasst. Zur Proteinfluoreszenzmarkierung wurden Alexa488-NHS-Ester (Yeasen, 40779ES03) und Cy3-NHS-Ester (Yeasen, 40777ES03) mit SS18 bzw. SS18-SSX1 und BRG1 (1-282) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Molverhältnis von Fluorophor zu Protein betrug 2:1 und der pH-Wert der Lösung wurde mit 100 mM NaHCO3 auf pH 8,3 eingestellt. Die Reaktion wurde durch 200 mM Tris-HCl, pH 8,3, gequencht. Die markierten Proteine ​​wurden mit der Hitrap-Entsalzungssäule (GE Healthcare) weiter in den Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 150 mM NaCl) überführt.

HEK293T-, HS-SY-II- und CME-1-Zellen wurden in Glasbodenschalen (Nest, 801002) kultiviert und wie oben beschrieben mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. Nach 24-stündiger Transfektion wurden die Zellen mit einem konfokalen Zeiss LSM710-Mikroskop mit einer ×63-Ölimmersionslinse abgebildet und anschließend wurden die Daten mit der Zen Black v2011-Software gesammelt und verarbeitet. Für den FRAP-Assay wurden HeLa-Zellen auch in Glasbodenschalen kultiviert und wie oben beschrieben mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. Der FRAP-Assay wurde auch auf einem konfokalen Zeiss LSM710-Mikroskop bei 37 °C durchgeführt. Das Fluoreszenzsignal von GFP wurde mit einem 488-nm-Laserstrahl gebleicht. Der Fluoreszenzintensitätsunterschied zwischen dem Vorbleichen und dem Zeitpunkt 0 (dem Zeitpunkt unmittelbar nach dem Photobleichimpuls) wurde auf 100 % normalisiert.

Die Zellproliferation wurde mithilfe des EdU-Zellproliferationstests gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Etwa 1 × 105 Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät und vor dem Test 24 Stunden lang aufbewahrt. In jede Vertiefung wurden insgesamt 500 µL EdU (10 µM) Reagenz (Beyotime, C0071S) gegeben und 2 Stunden lang inkubiert, um die Zellen zu markieren. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 15 Minuten lang in einer 4%igen Paraformaldehydlösung (Dingguo Biotechnology, AR-0211) fixiert, weitere 15 Minuten lang mit 0,3% Triton X-100 (GenStar, VA11410) permeabilisiert und dann mit inkubiert Das Click-Reaktionsreagenz für 30 Minuten bei Raumtemperatur in der dunklen Umgebung. Insgesamt wurde 1× Hoechst33342-Reagenz zur Gegenfärbung des Zellkerns verwendet. Das Ergebnis der Färbung wurde mit einem Fluoreszenzmikroskopsystem Nikon ECLIPSE Ti-S beobachtet und die Daten wurden mit der Software NIS-Elements F v4.0 erfasst.

Die NIH3T3-Zellen exprimierten stabil den leeren Vektor oder den Wildtyp SS18-SSX1, und seine Mutanten wurden in Platten mit sechs Vertiefungen mit 1,0 × 103 Zellen pro Vertiefung in Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % FBS, ausplattiert und 3 Wochen lang bei 37 °C inkubiert. Das Kulturmedium wurde alle 3–5 Tage gewechselt. Nach 3 Wochen wurden die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd (Dingguo Biotechnology, AR-0211) fixiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 % Kristallviolett (Sigma-Aldrich, V5265) gefärbt, dann wurden die Zellen gewaschen mit Wasser und machte schließlich nach dem Trocknen an der Luft ein Foto. Diese Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Zellmigrations- und Invasionstests wurden unter Verwendung eines 24-Well-Transwell-Kammersystems (Corning, 3422) durchgeführt. Eine Transwell-Apparatur wurde durch Polycarbonatfilter (8 μm Poren) in obere und untere Kammern getrennt. Für Migrationstests exprimierten die NIH3T3-Zellen stabil den leeren Vektor oder den Wildtyp SS18-SSX1 und seine Mutanten (4,0 × 104) wurden in 200 μl Wachstumsmedium in der oberen Kammer suspendiert. Für Invasionstests wurden die Polycarbonatfilter vor der Zellaussaat mit 300 μg/ml Matrigel (Corning, 356234) beschichtet. Die untere Kammer enthielt 750 μl Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % FBS. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator wurden die Zellen auf der oberen Filteroberfläche durch Abwischen mit einem Wattestäbchen entfernt. Die Filter wurden dann in 4 % Paraformaldehyd (Dingguo Biotechnology, AR-0211) fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett (Sigma-Aldrich, V5265) gefärbt. Alle Zellen, die zur unteren Filteroberfläche wanderten, wurden unter einem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung gezählt. Jeder Assay wurde dreifach durchgeführt.

Jedes Experiment mit analytischer Gelfiltration und SDS-PAGE (Ergänzende Abbildungen 1a–e und 5a, b), Co-IP-Assays (Ergänzende Abbildungen 1i, 4a, b und 5f) und Western-Blot-Assays (Abb. 6a) wurden zweimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt und ein repräsentatives Ergebnis wurde gezeigt. Für die Daten der Phasentrennung wurden Tröpfchenbildungstests in vitro (Abb. 3b, 4d, g und 5a, e) und konfokale Bilder lebender Zellen (Abb. 3f, 4e, f und 5f, h) von drei aufgenommen Es handelte sich um ein unabhängiges Experiment, und für jede Probe wurden mehr als 6 Bilder aufgenommen. Sie zeigten ähnliche Ergebnisse, daher wurden die repräsentativen Mikroskopiebilder gezeigt. Das Sedimentationsexperiment (ergänzende Abbildung 6c) wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mit der Software GraphPad Prism v8.0 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Einfaktorielle ANOVA, Mehrfachvergleichstest nach Tukey, **** für P < 0,0001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Nukleotidsequenzen von Hefe SNF11 und SNF2 wurden aus Genomdatenbanken von Saccharomyces cerevisiae mit der SGD-ID S00002480 bzw. S00005816 erhalten. Die Daten zu Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die Kristallstruktur des BRG1/SS18- und SNF11/SNF2-Komplexes wurden in der Datenbank der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 7VRB bzw. 7VRC hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in diesem Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind.

Nielsen, TO, Poulin, NM & Ladanyi, M. Synovialsarkom: Aktuelle Entdeckungen als Wegweiser für neue Therapiemöglichkeiten. Krebsentdeckung. 5, 124–134 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clark, J. et al. Identifizierung neuer Gene, SYT und SSX, die an der t(X;18)(p11.2;q11.2)-Translokation im menschlichen Synovialsarkom beteiligt sind. Nat. Genet. 7, 502–508 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Leeuw, B., Balemans, M., Olde Weghuis, D. & Geurts van Kessel, A. Identifizierung von zwei alternativen Fusionsgenen, SYT-SSX1 und SYT-SSX2, in t(X;18)(p11.2; q11.2)-positive Synovialsarkome. Summen. Mol. Genet. 4, 1097–1099 (1995).

Artikel PubMed Google Scholar

Skytting, B. et al. Ein neues Fusionsgen, SYT-SSX4, im Synovialsarkom. J. Natl Cancer Inst. 91, 974–975 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

El Beaino, M. et al. Synovialsarkom: eine komplexe Krankheit mit vielfältigen Signal- und epigenetischen Landschaften. Curr. Onkol. Rep. 22, 124 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cenik, BK & Shilatifard, A. COMPASS- und SWI/SNF-Komplexe in Entwicklung und Krankheit. Nat. Rev. Genet. 22, 38–58 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kato, H. et al. SYT assoziiert mit menschlichen SNF/SWI-Komplexen und die C-terminale Region seines Fusionspartners SSX1 zielt auf Histone ab. J. Biol. Chem. 277, 5498–5505 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Middeljans, E. et al. SS18 definiert zusammen mit tierspezifischen Faktoren menschliche SWI/SNF-Komplexe vom BAF-Typ. PLoS ONE 7, e33834 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perani, M., Ingram, CJ, Cooper, CS, Garrett, MD & Goodwin, GH Die konservierte SNH-Domäne des Protoonkoproteins SYT interagiert mit Komponenten der menschlichen Chromatin-Remodelling-Komplexe, während die QPGY-Wiederholungsdomäne Homo-Oligomere bildet. Oncogene 22, 8156–8167 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ishida, M., Tanaka, S., Ohki, M. & Ohta, T. Die transkriptionelle Co-Aktivatoraktivität von SYT wird durch BRM und Brg1 negativ reguliert. Genes Cells 9, 419–428 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Er, S. et al. Struktur des nukleosomengebundenen menschlichen BAF-Komplexes. Wissenschaft 367, 875–881 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Mashtalir, N. et al. Ein Strukturmodell des endogenen menschlichen BAF-Komplexes informiert über Krankheitsmechanismen. Zelle 183, 802–817 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kadoch, C. & Crabtree, GR Reversible Störung von mSWI/SNF (BAF)-Komplexen durch die onkogene SS18-SSX-Fusion bei Synovialsarkomen. Zelle 153, 71–85 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McBride, MJ et al. Das SS18-SSX-Fusionsonkoprotein entführt die BAF-Komplex-Targeting-Funktion und die Funktion, Synovialsarkome voranzutreiben. Krebszelle 33, 1128–1141 (2018). e1127.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagai, M. et al. Analyse der transformierenden Aktivität des humanen Synovialsarkom-assoziierten chimären Proteins SYT-SSX1, gebunden an den Chromatin-Remodeling-Faktor hBRM/hSNF2 alpha. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 98, 3843–3848 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thaete, C. et al. Funktionelle Domänen der Synovialsarkom-Translokationsproteine ​​SYT und SYT-SSX und Co-Lokalisierung mit dem SNF-Protein BRM im Zellkern. Summen. Mol. Genet. 8, 585–591 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chong, S. et al. Abbildung dynamischer und selektiver Domäneninteraktionen mit geringer Komplexität, die die Gentranskription steuern. Science 361, eaar2555 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wang, J. et al. Eine molekulare Grammatik, die die treibenden Kräfte für die Phasentrennung von Prion-ähnlichen RNA-Bindungsproteinen regelt. Zelle 174, 688–699 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, RB, Kaur, T., Moosa, MM & Banerjee, PR FUS-Onkofusionsproteinkondensate rekrutieren mSWI/SNF-Chromatin-Remodeler über heterotypische Wechselwirkungen zwischen prionähnlichen Domänen. Proteinwissenschaft. 30, 1454–1466 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Han, Y., Reyes, AA, Malik, S. & He, Y. Kryo-EM-Struktur des an ein Nukleosom gebundenen SWI/SNF-Komplexes. Natur 579, 452–455 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, C. et al. Struktur des Hefe-Swi/Snf-Komplexes im nukleosomenfreien Zustand. Nat. Komm. 11, 3398 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Treich, I., Cairns, BR, de los Santos, T., Brewster, E. & Carlson, M. SNF11, eine neue Komponente des Hefe-SNF-SWI-Komplexes, die mit einer konservierten Region von SNF2 interagiert. Mol. Zelle. Biol. 15, 4240–4248 (1995).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dosztanyi, Z. Vorhersage einer Proteinstörung basierend auf IUPred. Proteinwissenschaft. 27, 331–340 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, Y., Currie, SL & Rosen, MK Intrinsisch ungeordnete Sequenzen ermöglichen die Modulation der Proteinphasentrennung durch verteilte Tyrosinmotive. J. Biol. Chem. 292, 19110–19120 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Patel, SS, Belmont, BJ, Sante, JM & Rexach, MF Nativ entfaltete Nukleoporine steuern die Proteindiffusion durch den Kernporenkomplex. Zelle 129, 83–96 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kroschwald, S. et al. Promiskuitive Wechselwirkungen und Proteindisaggregasen bestimmen den Materialzustand stressinduzierbarer RNP-Granula. eLife 4, e06807 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wheeler, JR, Matheny, T., Jain, S., Abrisch, R. & Parker, R. Unterschiedliche Phasen beim Aufbau und Abbau von Spannungsgranulaten. eLife 5, e18413 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeng, M. et al. Der Phasenübergang in der postsynaptischen Dichte liegt der Bildung synaptischer Komplexe und der synaptischen Plastizität zugrunde. Zelle 166, 1163–1175 (2016). e1112.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brett, D. et al. Das SYT-Protein, das an der Translokation des t(X;18)-Synovialsarkoms beteiligt ist, ist ein Transkriptionsaktivator, der in Kernkörperchen lokalisiert ist. Summen. Mol. Genet. 6, 1559–1564 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

dos Santos, NR et al. Kernlokalisation von SYT, SSX und den Synovialsarkom-assoziierten SYT-SSX-Fusionsproteinen. Summen. Mol. Genet. 6, 1549–1558 (1997).

Artikel PubMed Google Scholar

McBride, MJ et al. Der Nukleosomen-Säurefleck und die H2A-Ubiquitinierung liegen der mSWI/SNF-Rekrutierung bei Synovialsarkomen zugrunde. Nat. Struktur. Mol. Biol. 27, 836–845 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuang, J. et al. SS18 reguliert den pluripotent-somatischen Übergang durch Phasentrennung. Nat. Komm. 12, 4090 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McSwiggen, DT, Mir, M., Darzacq, X. & Tjian, R. Bewertung der Phasentrennung in lebenden Zellen: Diagnose, Vorbehalte und funktionelle Konsequenzen. Genes Dev. 33, 1619–1634 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soulez, M., Saurin, AJ, Freemont, PS & Knight, JC SSX und das Synovialsarkom-spezifische chimäre Protein SYT-SSX kolokalisieren mit dem menschlichen Polycomb-Gruppenkomplex. Oncogene 18, 2739–2746 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

dos Santos, NR, de Bruijn, DR, Kater-Baats, E., Otte, AP & van Kessel, AG Abgrenzung der Proteindomänen, die für die Kernlokalisierung von SYT, SSX und SYT-SSX verantwortlich sind. Exp. Zellauflösung 256, 192–202 (2000).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Kadoch, C. & Crabtree, GR Säugetier-SWI/SNF-Chromatin-Remodelling-Komplexe und Krebs: Mechanistische Erkenntnisse aus der Humangenomik. Wissenschaft. Adv. 1, e1500447 (2015).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Su, L. et al. Dekonstruktion des SS18-SSX-Fusions-Onkoproteinkomplexes: Einblicke in die Ätiologie und Therapie von Krankheiten. Krebszelle 21, 333–347 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morgan, MA & Shilatifard, A. Epigenetische Verwirrung: SS18-SSX-Fusion verdrahtet den BAF-Komplex neu, um bivalente Gene im Synovialsarkom zu aktivieren. Krebszelle 33, 951–953 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, J. et al. Eine Rolle von SMARCB1 bei der Synovialsarkomagenese zeigt, dass SS18-SSX die kanonische BAF-Zerstörung induziert. Krebsentdeckung. 11, 2620–2637 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banito, A. et al. Das SS18-SSX-Onkoprotein entführt KDM2B-PRC1.1, um das Synovialsarkom auszulösen. Krebszelle 34, 346–348 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zbinden, A., Perez-Berlanga, M., De Rossi, P. & Polymenidou, M. Phasentrennung und neurodegenerative Erkrankungen: eine Störung der Kraft. Entwickler Zelle 55, 45–68 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McGurk, L. et al. Die nukleare Poly(ADP-Ribose)-Aktivität ist ein therapeutisches Ziel bei der amyotrophen Lateralsklerose. Acta Neuropathol. Komm. 6, 84 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schuck, P. Zur Analyse der Proteinselbstassoziation durch Sedimentationsgeschwindigkeitsanalytische Ultrazentrifugation. Anal. Biochem. 320, 104–124 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schuck, P. Größenverteilungsanalyse von Makromolekülen durch Sedimentationsgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation und Lamm-Gleichungsmodellierung. Biophys. J. 78, 1606–1619 (2000).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, W.-Z. et al. Die Proteinkomplex-Kristallographie-Strahllinie (BL19U1) an der Shanghai Synchrotron Radiation Facility. Nukl. Wissenschaft. Technik. 30, 170 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Terwilliger, TC et al. Entscheidungsfindung bei Strukturlösungen mithilfe von Bayes'schen Schätzungen der Kartenqualität: der PHENIX AutoSol-Assistent. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 65, 582–601 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terwilliger, TC et al. Iterative Modellbildung, Strukturverfeinerung und Dichteänderung mit dem PHENIX AutoBuild-Assistenten. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 64, 61–69 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schneider, TR & Sheldrick, GM Unterkonstruktionslösung mit SHELXD. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 58, 1772–1779 (2002).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, IW et al. MolProbity: All-Atom-Kontakte und Strukturvalidierung für Proteine ​​und Nukleinsäuren. Nukleinsäuren Res. 35, W375–W383 (2007).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wallace, AC, Laskowski, RA & Thornton, JM LIGPLOT: ein Programm zur Erstellung schematischer Diagramme von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Protein Eng. 8, 127–134 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken den Mitarbeitern der Strahllinie BL19U1 der National Facility for Protein Science in Shanghai (NFPS) der Shanghai Synchrotron Radiation Facility für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung und wir danken Wenxin Long für die englische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant-Nummern 32171208 und 31870750 an HZ); von der Natural Science Foundation of Tianjin [Grant-Nummer 20JCYBJC01320 an JL]; durch das Shenzhen Science and Technology Programm (Grant-Nummer JCYJ20210324122212034 an JL); und von Fundamental Research Funds for the Central Universities, Nankai University (Grant-Nummer 030/63211052 an JL).

Staatliches Schlüssellabor für medizinische chemische Biologie, Tianjin Schlüssellabor für Proteinwissenschaft und Hochschule für Biowissenschaften, Nankai-Universität, 94 Weijin Road, 300071, Tianjin, China

Yanli Cheng, Zhongtian Shen, Yaqi Gao, Feilong Chen, Huisha Xu, Qinling Mo, Hao Zhou und Jiafu Long

Abteilung für Epidemiologie und Biostatistik, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 300060, Tianjin, China

Xinlei Chu

Abteilung für Orthopädie, Zweites Krankenhaus, Medizinische Fakultät, Shandong-Universität, 250033, Jinan, China

Chang-liang Peng

Abteilung für Krebsbiologie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, UT Health Graduate School of Biomedical Sciences, Houston, TX, 77030, USA

Takese T. McKenzie, Bridgitte E. Palaces und Jian Hu

Nankai International Advanced Research Institute (Shenzhen Futian), 518045, Shenzhen, Guangdong, China

Jiafu Long

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

YC, HZ und JL haben die Forschung entworfen. YC, ZS, FC, YG, HX, QM, XC, C.-LP, TTM und HZ führten Untersuchungen durch. YC, HZ und JL analysierten die Daten und erstellten die Zahlen. YC, BEP, JH, HZ und JL haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. JL koordinierte die Forschung.

Korrespondenz mit Hao Zhou oder Jiafu Long.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Ernst Schönbrunn und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Cheng, Y., Shen, Z., Gao, Y. et al. Der Phasenübergang und der Umbaukomplexaufbau sind wichtig für die onkogene Aktivität von SS18-SSX bei Synovialsarkomen. Nat Commun 13, 2724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30447-9

Zitat herunterladen

Eingegangen: 22. Oktober 2021

Angenommen: 26. April 2022

Veröffentlicht: 18. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30447-9

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.