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Jun 17, 2023

Neuartiger elektrochemischer PMI-Marker-Biosensor basierend auf der Quantenpunktauflösung mithilfe eines Doppels

Scientific Reports, Band 12, Artikelnummer: 8815 (2022) Diesen Artikel zitieren 1553 Zugriff auf 2 Altmetric Metrics-Details Ein neuartiger und einfacher Post-Mortem-Intervall (PMI)-Biosensor wurde unter Verwendung eines hergestellt

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8815 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mithilfe einer Doppelmarkierungsstrategie wurde ein neuartiger und einfacher Biosensor für das Post-Mortem-Intervall (PMI) hergestellt, um den Biomarker Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) zu erkennen. Ein monoklonaler Anti-GAPDH-Antikörper wurde auf einer Oberflächenmarkierung immobilisiert, die Cadmiumselenid-Quantenpunkte (CdSe-QDs) auf einer selbstorganisierten Monoschicht aus Cysteamin-Graphenoxid (Cys-GO) enthielt. Glucoseoxidase (GOx) wurde als Signalmarkierung für die Konjugation mit GAPDH verwendet. Die GAPDH-Erkennung wurde durch die Auflösung der oberflächengebundenen CdSe-QDs durch Wasserstoffperoxid erreicht, das durch GAPDH-konjugierte GOx-katalysierte β-Glucose-Oxidation erzeugt wurde. Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wurde eine kompetitive Wechselwirkung zwischen freiem und konjugiertem GAPDH am aktiven Zentrum des Anti-GAPDH-Antikörpers eingeführt. Die elektrochemische Reaktion aufgrund der CdSe-Auflösung nahm proportional mit der Konzentration an freiem GAPDH ab. Zur Bestimmung der analytischen Eigenschaften des Immunsensors, einschließlich der Nachweisgrenze, des linearen dynamischen Bereichs, der Zielselektivität, der Systemstabilität und der Anwendbarkeit für die Analyse realer Proben wurde eine differenzielle gepulste Voltammetrie durchgeführt.

Das Post-Mortem-Intervall (PMI) ist die Zeit, die seit dem Tod einer Person verstrichen ist. Die PMI-Schätzung wird im Allgemeinen mit einfachen Techniken durchgeführt, einschließlich Livor, Algor und Totenstarre. Eine genaue Schätzung des PMI ist jedoch unerlässlich, da sie wichtige Hinweise für die Untersuchung der Todesursache und des Todeszeitpunkts liefern kann. Leider ist die genaue Bestimmung des PMI sehr schwierig und erfordert viele medizinische/wissenschaftliche Techniken und eine lange Bearbeitungszeit. Daher besteht ein dringender Bedarf, eine einfache und schnelle Methode zur PMI-Erkennung zu entwickeln. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) ist ein Protein, das im Speichel und in der Niere vorkommt1 und dessen Konzentration mit der Zeit nach dem Tod abnimmt2. Diese Eigenschaft des GAPDH-Proteins kann als geeigneter Proteinbiomarker für die Entwicklung eines PMI-Biosensorsystems genutzt werden.

In Biosensorsystemen, die an der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beteiligt sind (Immunsensoren)3, wurden verschiedene Nachweismethoden eingesetzt, wie z. B. Chemilumineszenz4, Oberflächenplasmonenresonanz5, Quarzkristall-Mikrowaage6 und elektrochemische Sensortechniken7. Unter diesen hat die Verwendung eines elektrochemischen Immunsensors aufgrund der hohen Empfindlichkeit und Selektivität des Sensors große Aufmerksamkeit erregt8, 9. Außerdem haben elektrochemische Immunsensoren aufgrund ihrer geringen Kosten, einfachen Messung, schnellen Reaktion usw. Vorteile für die Erkennung von Proteinbiomarkern gezeigt Eignung für Point-of-Care-Anwendungen10,11,12. Die Entwicklung eines elektrochemischen Immunsensors zur PMI-Erkennung wurde jedoch selten durchgeführt2. Durch die Verwendung von Nanomaterialien zur Vergrößerung der Sensoroberfläche wurde in dieser Studie ein hochempfindlicher elektrochemischer Immunsensor zum Nachweis von GAPDH-Biomarkern entwickelt. Der PMI-Immunsensor wurde hergestellt, indem ein monoklonaler GAPDH-Antikörper gegen Quantenpunkte (QDs) aus Cadmiumselenid (CdSe) fixiert wurde, die an der selbstorganisierten Monoschicht (SAM) aus Cysteamin mit Graphenoxid (GO) befestigt waren. Die GAPDH-Erkennung wurde durch die Auflösung von CdSe-QDs in Wasserstoffperoxid13,14,15 erreicht, das durch die durch Glucoseoxidase (GOx) katalysierte β-Glucoseoxidation16 erzeugt wurde. GOx wurde als enzymatische Markierung verwendet, die durch Glutaraldehyd-Vernetzung an das GAPDH-Protein konjugiert wurde17. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit wurde eine kompetitive Wechselwirkung zwischen GAPDH-GOx-Konjugaten und freiem GAPDH mit dem aktiven Zentrum von Anti-GAPDH18 eingeführt. Die aktuelle Reaktion aufgrund der CdSe-Auflösung nahm proportional zur erhöhten Konzentration an freiem GAPDH ab. Daher war es mit dieser Strategie möglich, freies GAPDH zu quantifizieren, und es wurde eine differenzielle gepulste Voltammetrie (DPV) durchgeführt, um die analytischen Eigenschaften eines Immunsensors zu bestimmen, einschließlich der Nachweisgrenze, des linearen dynamischen Bereichs, der Zielselektivität, der Systemstabilität und der Anwendbarkeit auf die Analyse realer Proben19.

Cysteamin, Graphenoxid (2 mg/ml, Dispersion in H2O), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC), N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (NHS), dibasisches Natriumphosphat, einbasiges Natriumphosphat, Glutaraldehydlösung , Natriumchlorid, Sephadex G-25, Glucoseoxidase (aus Aspergillus niger), β-D-Glucosepentaacetat, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Trizma (NH2C(CH2OH)3·HCl) (Tris), Rinderserumalbumin ( BSA), prostataspezifisches Antigen (PSA), karzinoembryonales Antigen (CEA), c-reaktives Protein (CRP), menschliches Immunglobulin G (hIgG), Meerrettichperoxidase (HRP) und menschliche Serumproben wurden von Sigma-Aldrich Co. bezogen. Salzsäure wurde von Junsei Co. erworben und menschliches α-Thrombin wurde von Haematologic Technologies Inc. bezogen. Der GAPDH-Antikörper (Sc-25778) wurde von Santa Cruz Co. bezogen und die GAPDH-Lösung (Konzentration: 10,532 mg/ml) wurde von Santa Cruz Co. bezogen Cosmogenetech Co., Südkorea. Die QDs (CdSe/ZnS mit aktiver Carbonsäuregruppe in Wasser, 520 nm Emission/450 nm Absorption) wurden von Global Zeus Co., Südkorea, gekauft. Alle Chemikalien hatten analytische Qualität und wurden ohne weitere Modifikation verwendet. Alle wässrigen Lösungen wurden mit entionisiertem (DI) Wasser aus einem Milli-Q-Wasseraufbereitungssystem (18 MΩ·cm) hergestellt. Die elektrochemischen Auswertungen wurden in 0,1 mM Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) durchgeführt. Alle Lösungen wurden mehr als 15 Minuten lang mit 99,9 % reinem Stickstoff desoxidiert.

Elektrochemische Bewertungstechniken wie DPV und zyklische Voltammetrie (CV) wurden mit einem Potentiostat/Galvanostat (CHI660D, CH Instruments Inc, USA) gemessen. Für DPV wurden Ag/AgCl (gesättigtes KCl) und Platin (Pt) als Referenz- bzw. Gegenelektroden verwendet. Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) wurden auf einem REM-System (CLARA, TESCAN, Tschechische Republik) durchgeführt. Konfokale Mikroskopbilder wurden mit einem konfokalen Rastermikroskop (LSM 880 mit Airyscan, Carl Zeiss, Deutschland) aufgenommen. Die Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-Vis) wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (Optizen POP, Mecasys, Republik Korea) durchgeführt.

Die Immunosensor-Plattform wurde durch GO-integriertes SAM von Cysteamin (Cys) durch chemische Bindung modifiziert20. Zuerst wurden die Au-Elektroden mit einer 0,05 µm dicken Aluminiumoxid/Wasser-Aufschlämmung auf einem Poliertuch poliert. Als nächstes wurde die polierte Elektrode beschallt und mit entionisiertem Wasser gespült. Anschließend wurde die hochglanzpolierte Elektrode mit einer Piranha-Lösung (70 % H2SO4 und 30 % H2O2) ausgewaschen, vollständig mit entionisiertem Wasser gespült und in einem Ofen getrocknet. Die Cys-GO-Lösung wurde durch Mischen von 36 mM Cys in entionisiertem Wasser mit 10 µg/ml GO hergestellt. Die endgültige Mischung (5 µL) wurde auf die Au-Elektrode getropft und zur Selbstorganisation 8 Stunden21,22 lang aufbewahrt. Die Carbonsäuregruppen auf QDs wurden mit 10 mM EDC/NHS-Lösung23 aktiviert und die Au/Cys-GO-modifizierte Oberfläche wurde 10 Stunden lang kovalent an die aktivierten QDs gebunden (Au/Cys-GO/QD)24. Nach dem Waschen wurde die Au/Cys-GO/QD-Elektrode 4 Stunden lang in einer 0,1 M PBS-Lösung (pH 7,0) mit 1 µg/ml Anti-GAPDH inkubiert25,26,27. Der GAPDH-Antikörper (Ab) wurde über die Amidbindungen zwischen der Carboxylgruppe des QD und der Amingruppe von Anti-GAPDH (Au/Cys-GO/QD/Anti-GAPDH) auf den QDs immobilisiert. Danach wurde die Elektrode dreimal mit 0,1 M PBS gewaschen und dann 1 Stunde lang in 0,05 % BSA-Lösung gelegt, um die unspezifische Absorption anderer Proteine ​​zu blockieren. Nach drei- oder viermaligem Spülen mit PBS wurde der BSA-blockierte Au/Cys-GO/QD/Anti-GAPDH-Immunsensor im Kühlschrank bei 4 °C gelagert. Abbildung 1 beschreibt die Gesamtherstellung des GAPDH-Immunsensors.

Schematische Darstellung des GAPDH-Nachweises mithilfe des QD-Auflösungs-Immunsensors.

Die GOx/GAPDH-Konjugate wurden gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt28, 29. Zuerst wurden 50 µg/ml GAPDH in 1,0 M PBS und 0,5 ml 25 % Glutaraldehyd 18 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) gemischt (glu-GAPDH). . Überschüssiger Glutaraldehyd wurde durch eine Sephadex G-25-Säule in 10 mM Tris/1 mM EDTA (pH 7,5), äquilibriert mit 0,9 % NaCl, filtriert. Anschließend wurden 3 ml GOx (1,0 mg/ml) in 1 M PBS-Lösung mit 6 ml glu-GAPDH gemischt, um eine kovalente Vernetzung zwischen GOx und glu-GAPDH zu induzieren. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei RT inkubiert (konjugiertes GAPDH). Um die unspezifische Bindung des verbleibenden aktiven Zentrums des hergestellten Konjugats zu verhindern, wurde die Blockierung mit 0,1 % (w/v) BSA-Lösung durchgeführt und die Dialyse in 0,1 M PBS (pH 7,4) durchgeführt. Abschließend wurde das Konjugat durch eine sterile Millipore-Membran (0,20 µm) filtriert und dann bei –20 °C gelagert.

Abbildung 2 zeigt die SEM-Bilder von GO-, Cys-GO- und Cys-GO/QD-modifizierten Au-Oberflächen. Die GO-Elektrode zeigte im REM-Bild eine dicke und raue Morphologie. Bei der Cys-GO-Elektrode wurde ein großer Fleck auf der glatten SAM-Oberfläche beobachtet, was bestätigt, dass GO in Cys eingebaut war. Die Cys-GO/QD-modifizierte Au-Oberfläche zeigte einige Ableger aufgrund der QD-Anlagerung nach der QD-Bindung. Allerdings handelt es sich bei den QDs um kleine Nanopartikel mit einer Größe von 5 nm; Daher sind sie auf den Bildern nicht sichtbar.

SEM-Bilder von (a) GO-, (b) Cys-GO- und (c) Cys-GO/QD-modifizierten Oberflächen. (d) GO-, (e) Cys-GO- und (f) Cys-GO/QD-EDS-Spektren erhalten für Au/GO (i), Au/Cys-GO (ii) und Au/Cys-GO/QD (iii) modifizierte Oberflächen.

EDS wurde durchgeführt, um die Oberfläche der Au/Cys-GO/QD-Elektrode zu charakterisieren (Abb. 2). Die Untersuchungsspektren von Au/GO und Au/Cys-GO zeigten das Vorhandensein von C, O, S und K bzw. C, N, O und S an. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Au/Cys-GO/QD-Elektrode C, N, O, S und Cd enthält. Das Vorhandensein von Cd auf der Oberfläche zeigte die erfolgreiche Immobilisierung der QDs auf dem Immunsensor an.

Eine XPS-Analyse wurde durchgeführt, um die kovalente Bindung von QD mit Au/Cys-GO zu charakterisieren, wie in Abb. S1 dargestellt. Der C1S-Peak in Au/Cys-GO/QD und der N1S-Peak in Au/Cys-GO, die zu höheren bzw. niedrigeren Energien verschoben sind, weisen deutlich auf die Bildung der kovalenten Bindung zwischen der Carbonsäure von QD und den Amingruppen von Cysteamin hin in Au/Cys-GO.

Zur weiteren Charakterisierung der GAPDH-Immunsensoroberfläche wurde eine konfokale Mikroskopie durchgeführt. Abb. S2 zeigt die Fluoreszenzbilder von Au/Cys und Au/Cys-GO/QD. Die Fluoreszenz war aufgrund der QD-Emission auf der Au/Cys-GO/QD-Elektrodenoberfläche erkennbar, wohingegen die Au/Cys-Elektrode keine Fluoreszenz aufwies. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die QDs erfolgreich auf der Au/Cys-GO-Oberfläche immobilisiert wurden.

Das elektrochemische Verhalten der Au/Cys-GO/QD-Elektrode wurde mittels CV analysiert. Abb. S3 zeigt die CV-Profile der Au/Cys-, Au/Cys-GO- und Au/Cys-GO/QD-modifizierten Elektroden in PBS. Für die Au/Cys-modifizierte Elektrode wurde ein sehr kleiner Redoxpeak beobachtet, da keine elektroaktiven Materialien wie Nanopartikel für die Redoxreaktion vorhanden waren. Darüber hinaus wurde für die Au/Cys-GO-modifizierte Elektrode ein deutlich erhöhter Redoxpeak zwischen −0,1 V und 0,3 V gegenüber Ag/AgCl beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Einführung von GO die Leitfähigkeit verbesserte und den maximalen Strom erhöhte. Nach der Au/Cys-GO/QD-Modifikation befand sich der Redoxpeak an derselben Position wie der für die Au/Cys-GO-Elektrode beobachtete, mit einem Anstieg des Spitzenstroms. Der Abstand zwischen den Reduktions- und Oxidationspeaks wurde mit 0,4 V berechnet, was auf eine quasi-reversible Elektronentransferreaktion schließen lässt. Tabelle S1 zeigt die Anstiegsrate des Redox-Peaks, was auf einen allmählichen Anstieg des Stroms nach weiteren Schritten hinweist. Diese Analyseergebnisse bestätigten, dass Cys-GO/QD mit elektroaktiven Eigenschaften erfolgreich auf der Au-Elektrodenoberfläche immobilisiert wurde und für die Herstellung des GAPDH-Immunsensors verwendet werden kann.

Die QD-Auflösung wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie analysiert. Abb. S4 zeigt die UV/Vis-Spektren, die für 10 µg/ml QDs, 10 µg/ml QDs, die 5 Minuten lang mit 5 % H2O2 reagierten, und 10 µg/ml QDs, die 5 Minuten lang mit 1 % H2O2 reagierten, erhalten wurden. Wie erwartet zeigten die QDs einen Peak zwischen 440 und 460 nm. Nachdem die QDs mit H2O2 reagiert hatten, war die Absorption deutlich verringert; Die hohe H2O2-Konzentration ergab eine geringere Absorption als die niedrige Konzentration, was bestätigt, dass die QD-Auflösung mit der Anwesenheit von H2O2 zusammenhängt.

Um die beste Reaktion bei der Analyse realer Proben zu erzielen, wurde das Verdünnungsverhältnis des Antikörpers optimiert. Abb. S5 zeigt die Reaktion der Anti-GAPDH-Antikörper auf die in verschiedenen Verhältnissen von 1:2000 bis 1:40 verdünnten Nachweissonden unter Bedingungen von 1 ng/ml freiem GAPDH. Die aktuelle Reaktion nahm deutlich zu, wenn der Ab-Verdünnungsfaktor zwischen 1:2000 und 1:200 variierte, und nahm nicht weiter zu, wenn der Verdünnungsfaktor 1:200 oder höher betrug. Somit wurde das optimale Anti-GAPDH-Antikörperverhältnis auf 1:200 festgelegt. Die Optimierung des pH-Werts und der Inkubationszeit ist wichtig für die maximale Empfindlichkeit eines auf Antikörper-Antigen-Interaktion basierenden Immunsensors. Allerdings haben wir in dieser Studie nicht versucht, den pH-Wert und die Inkubationszeit zu optimieren, da unser Ziel darin bestand, diesen Immunsensor bei einem physiologischen pH-Wert (pH=7,0 ~ 7,4) zu verwenden. Bezüglich der Inkubationszeit der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung zeigten frühere Ergebnisse zur Antikörper-Antigen-Bindung, dass Inkubationen von 30 Minuten bis 2 Stunden für maximale Reaktionen geeignet sind25,26,27. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die meisten Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen für eine ähnliche Bindung erforderlich sind Zeit haben wir nicht versucht, es zu optimieren. Für eine maximale Antikörper-Antigen-Bindung verwendeten wir jedoch eine Inkubationszeit von 4 Stunden, da der Inkubationsschritt bei 4 °C durchgeführt wurde.

DPV ist eine sensiblere Technik als CV; Daher wurde es zur Quantifizierung von freiem GAPDH verwendet. Abbildung 3 zeigt die DPV-Reaktionen, die nach der Auflösung von QDs bei verschiedenen Konzentrationen an freiem GAPDH im Bereich zwischen 10 fg/ml und 100 ng/ml gemessen wurden. Die Reaktion wurde nach 10-stündiger Inkubation des Immunsensors in PBS mit konjugiertem GAPDH und verschiedenen GAPDH-Konzentrationen gemessen. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurde aufgrund der Auflösung von Cd zu Cd+ ein Stripping-Peak bei −0,43 V vs. Ag/AgCl beobachtet. Als nächstes wurde der Immunsensor sowohl mit konjugiertem GAPDH als auch mit freiem GAPDH in PBS platziert. Freies GAPDH konkurrierte um die Bindung an die aktiven Stellen des Anti-GAPDH-Antikörpers; Somit wurde die Menge an konjugiertem GAPDH, das an die aktiven Stellen des Antikörpers gebunden war, verringert und folglich verringerte sich der Reduktionsstrompeak des Cd-Strippings aufgrund der Anwesenheit von freiem GAPDH. Da das gebundene GOx, das mit β-Glucose in PBS-Lösungen interagiert, H2O2 30 erzeugt, könnte das enzymatisch erzeugte H2O2 das Cd-Metall von QDs auflösen. Daher nahm der Cd-Stripping-Peak allmählich ab und seine Intensität war proportional zur Menge an freiem GAPDH.

DPV-Reaktionen, die für den Immunsensor bei verschiedenen Konzentrationen an freiem GAPDH erhalten wurden.

Um einen empfindlichen GAPDH-Nachweis zu erreichen, wurde die analytische Durchführung unter optimierten Versuchsbedingungen durchgeführt. Wenn die Konzentration an freiem GAPDH erhöht und die Menge an konjugiertem GAPDH fixiert wurde, koppelte eine geringe Menge GOx über die kompetitive Bindungsstrategie31 an die Antikörperbindungsstellen und erzeugte eine geringe Menge H2O2 für die QD-Auflösung. Infolgedessen nahm die Intensität des Cd-Stripping-Peaks nicht wesentlich ab. Die Reaktion des Strippstroms nahm mit der Abnahme der Konzentration an freiem GAPDH in PBS zu und es wurde eine direkte lineare Beziehung zwischen der Stromreaktion und der Konzentration an freiem GAPDH beobachtet, was die Quantifizierung von freiem GAPDH durch diese Auflösungsstrategie ermöglichte.

Abbildung 4 zeigt das Kalibrierungsdiagramm unter Verwendung der aus Abb. 3 erhaltenen Strippstromintensität. Der lineare Bereich der GAPDH-Detektion wurde auf 10 fg/ml bis 100 ng/ml festgelegt. Die lineare Abhängigkeit zwischen der Intensität und der Konzentration an freiem GAPDH ergab eine Regressionsgleichung von I (y) = 0,0969 · log x + 0,7769 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9802. Die relative Standardabweichung betrug etwa 5,16 % (n=5) bei einer GAPDH-Konzentration von 1 ng/ml. Basierend auf drei Messungen der Standardabweichung des Blindrauschens (95 % Konfidenzniveau, k = 3, n = 5) wurde die Nachweisgrenze mit 2 fg/ml bestimmt. Alle analytischen Parameter sind in Tabelle S2 zusammengefasst. Die in dieser Studie erhaltenen analytischen Parameter und die zuvor berichteten QD-basierten Biosensoren werden in Tabelle 132,33,34,35,36,37,38 verglichen, was die hohe Empfindlichkeit des in dieser Arbeit entwickelten GAPDH-Sensors zeigt.

Kalibrierungsdiagramm unter Verwendung der Abisolierstromreaktion.

Um die Selektivität zu untersuchen, wurde die kompetitive Bindung des Immunsensors mithilfe von konjugiertem GAPDH und ähnlichen Biomarkern wie PSA, karzinoembryonalem Antigen (CEA), CRP, menschlichem Immunglobulin G (hIgG), Meerrettichperoxidase (HRP) und Thrombin (TB) untersucht. Abbildung 5 zeigt die DPV-Antworten vor und nach einer Konkurrenzreaktion. Mit Ausnahme von GAPDH zeigten alle getesteten Proteine ​​nach dem Wettbewerb keine signifikanten aktuellen Veränderungen, was darauf hindeutet, dass der vorgeschlagene Immunsensor hochselektiv ist und die oben genannten Proteine ​​den GAPDH-Nachweis nicht beeinträchtigten.

Selektivitätsstudie des elektrochemischen Immunsensors GAPDH in Gegenwart anderer Proteine ​​(CEA, CRP, HRP, IGG, TB) unter 1 ng/ml-Bedingungen.

Die Stabilität des hergestellten Sensors wurde durch Messung der Reaktion von 100 pg/ml GAPDH über einen Monat bestimmt. Nach jeder Messung wurde der Immunsensor mit einer PBS-Lösung gewaschen und 5 Minuten lang in eine 0,2 M Gly-HCl-Pufferlösung (pH = 2,8) getaucht. Nach dreimaligem Waschen mit einer PBS-Lösung wurde der Immunsensor trocken bei 4 °C gelagert, bis er zur kompetitiven Bindung von freiem und konjugiertem GAPDH weiter verwendet wurde. Es wurde festgestellt, dass die aktuelle Reaktion über einen Monat hinweg nicht signifikant verringert war (0,516, 0,523, 0,488 und 0,482), wie in Abb. 6 dargestellt. Der Immunsensor behielt über einen Zeitraum von einem Monat fast 93,4 % seiner ursprünglichen Reaktion bei. Diese Ergebnisse zeigten, dass der GAPDH-Immunsensor nicht nur eine hohe Selektivität, sondern auch Langzeitstabilität aufwies.

Aktueller Lückenwert von 100 pg/ml GAPDH, getestet an verschiedenen Tagen.

Die Anwendbarkeit dieses GAPDH-Immunsensors für die Analyse realer Proben wurde anhand von menschlichem Blutserum untersucht. Zu diesem Zweck wurden Blutserumproben durch Aufstocken mit 0,1 ng/ml ±0,03 und 0,2 ng/ml GAPDH hergestellt. Zur Berechnung der GAPDH-Konzentration wurde die Standardadditionsmethode verwendet; Das erhaltene Diagramm ist in Abb. 7 dargestellt. Die Konzentration von GAPDH wurde bei 0,1 ± 0,03 und 0,19 ± 0,03 ng/ml nachgewiesen. Die Wiederfindung betrug bei der ersten Probe fast 100 % und bei der zweiten Probe 95 %, was auf eine akzeptable Genauigkeit hinweist. Dieses Ergebnis bestätigt, dass der vorgeschlagene GAPDH-Immunsensor für den GAPDH-Nachweis in echten menschlichen Serumproben eingesetzt werden kann.

Standardadditionsdiagramm für den GAPDH-Nachweis in echten menschlichen Serumproben.

Wir haben einen elektrochemischen Immunsensor entwickelt, der auf der Cys-GO/QD-Plattform basiert, um den GAPDH-Biomarker für die PMI-Schätzung zu erkennen. Die Cys-GO/QD-Schicht verfügt über die Eigenschaften einer großen Oberfläche und einer hervorragenden Biokompatibilität, die die Immobilisierung von GAPDH-Antikörpern ermöglichen. Die Koexistenz von GO und QD verstärkte das elektrochemische Signal, indem es die Leitfähigkeit erhöhte und zahlreiche Elektronen für den Nachweis erzeugte. Noch wichtiger ist, dass die metallische Ablösung von QDs durch aus enzymatischen Markierungen erzeugtes H2O2 induziert wurde, und diese neuartige Sensorstrategie verbesserte die Nachweisempfindlichkeit weiter. Der entwickelte GAPDH-Immunsensor kann GAPDH in einer niedrigen Konzentration von 2,0 fg/ml mit einem breiten linearen Bereich zwischen 1,0 fg/ml und 100 ng/ml nachweisen. Die vorgeschlagene Erkennungsstrategie kann im forensischen Bereich für den Point-of-Care-Nachweis von GAPDH und anderen PMI-Biomarkern eingesetzt werden und ist vielversprechend für die PMI-Schätzung.

Während der aktuellen Studie wurden keine Datensätze generiert oder analysiert.

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Diese Forschung wurde durch das von der koreanischen Regierung finanzierte Stipendium der National Research Foundation (MSIP) (2015R1D1A1A01056721, Grundlagenforschungsprogramm für regionale Universitäten, 30 %) (2013R1A6A9067028, 2014 R&D Equipment Engineer Education Program, 10 %) und die Chungnam National University ( CNU)-Forschungsstipendium (2015-1252-01, 10 %), das von der koreanischen Regierung finanzierte Stipendium des Korea Basic Science Institute (MSIT) (C280320, 40 %) und das Stipendium des Institute of Information & communications Technology Planning & Evaluation (IITP). gefördert von der koreanischen Regierung (MSIT) (Nr. 2019-0-01106, Intelligente E-Nose-Entwicklung für die Gaserkennung im Sub-ppb-Bereich, 10 %).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bongjin Jeong und Rashida Akter.

Forschungslabor für intelligente Konvergenz, Forschungsinstitut für Elektronik und Telekommunikation, 34129, Daejeon, Republik Korea

Bongjin Jeong & Chang-Geun Ahn

Graduiertenschule für Analytische Wissenschaft und Technologie, Chungnam National University, 34134, Daejeon, Republik Korea

Bongjin Jeong, Rashida Akter, Jeonghyun Oh, Jong-Soon Choi & Md. Aminur Rahman

Abteilung für Biowissenschaften, Korea Basic Science Institute, 34133, Daejeon, Republik Korea

Dong-Gi Lee & Jong-Soon Choi

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BJ und RA trugen gleichermaßen bei. BJ und RA stellten die Konjugate und elektrochemischen Sensoren her, charakterisierten das Material und konzipierten die Biosensor-Experimente. BJ hat auch teilweise den ursprünglichen Entwurf dieses Manuskripts verfasst. JO unterstützte die Experimente. DL stellte die bimolekularen Ressourcen zur Verfügung. CA kümmerte sich um die Ressourcen. JC und MAR konzipierten das Projekt und kümmerten sich um die Konzeptualisierung, Methodik und Biosensorentwicklung und überprüften den ursprünglichen Entwurf.

Korrespondenz mit Bongjin Jeong, Jong-Soon Choi oder Md. Aminur Rahman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jeong, B., Akter, R., Oh, J. et al. Neuartiger elektrochemischer PMI-Marker-Biosensor basierend auf der Quantenpunktauflösung unter Verwendung einer Doppelmarkierungsstrategie. Sci Rep 12, 8815 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12444-6

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Eingegangen: 14. April 2022

Angenommen: 11. Mai 2022

Veröffentlicht: 25. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12444-6

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