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Aug 09, 2023

Osteogene Induktion von asiatischen Säurederivaten in menschlichen Stammzellen des parodontalen Bandes

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14102 (2023) Diesen Artikel zitieren 82 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Asiatic Acid (AA) und Asiaticosid, abgeleitet von pentazyklischen Triterpenoidverbindungen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14102 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Asiatische Säure (AA) und Asiaticosid, pentazyklische Triterpenoidverbindungen aus Centella asiatica, sind für ihre biologische Wirkung bei der Förderung der Kollagensynthese Typ I und der Induktion der Osteogenese von Stammzellen bekannt. Allerdings sind ihre Anwendungen in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer geringen Wirksamkeit und schlechten Wasserlöslichkeit begrenzt. Ziel dieser Arbeit war es, die osteogene Induktionsaktivität von AA-Derivaten in menschlichen parodontalen Bandstammzellen (hPDLSCs) in vitro zu bewerten. Vier Verbindungen wurden synthetisiert, nämlich 501, 502, 503 und 506. AA wurde als Kontrolle verwendet. Die 502-Verbindung zeigte eine geringe Wasserlöslichkeit, während die 506-Verbindung die höchste aufwies. Die Zytotoxizitätsanalyse zeigte, dass 503 eine signifikante Verschlechterung der Lebensfähigkeit der Zellen verursachte, während andere Derivate keine schädliche Wirkung auf hPDLSCs zeigten. Das Dimethylaminopropylamin-Derivat von AA, Verbindung 506, zeigte eine relativ hohe Wirksamkeit bei der Induktion der osteogenen Differenzierung. Bei 506 wurde eine erhöhte mRNA-Expression der osteogenen Gene BMP2, WNT3A, ALP, OSX und IBSP beobachtet. Darüber hinaus wurde die Expression des BMP-2-Proteins mit zunehmender Dosis von 506 verstärkt, und der Effekt war bei der Erk-Signalisierung ausgeprägter Molekül wurde gehemmt. Das 506-Derivat wurde zur Förderung der osteogenen Differenzierung in hPDLSCs durch Hochregulierung von BMP2 über den Erk-Signalweg vorgeschlagen. Das 506-Molekül erwies sich als vielversprechend bei der Regeneration von Knochengewebe.

Parodontitis ist eine entzündliche Erkrankung, die zum Verlust von Zahnfleisch, parodontalem Band und Alveolarknochen führt1,2,3. Die Regeneration des parodontalen Bandes ist eine der Behandlungsstrategien für parodontale Erkrankungen, die immer mehr Beachtung findet4.

Menschliche Stammzellen des parodontalen Bandes (hPDLSCs), die sich im parodontalen Band befinden (d. h. dem Bindegewebe, das Alveolarknochen und Zahnzement verbindet), stehen weiterhin im Mittelpunkt der Zelltherapie und des parodontalen Tissue Engineering. Diese Zellen besitzen die Stammzelleneigenschaft, die in mehrere Linien differenziert werden kann, einschließlich osteogener, adipogener, chondrogener, neurogener und pankreasähnlicher Zelllinien5,6,7,8,9,10,11,12. Ihre Rolle bei der Unterstützung der Gewebehomöostase und der Regeneration geschädigten Gewebes ist allgemein anerkannt13,14,15. Bei Tissue-Engineering- oder Parodontalstudien gelten hPDLSCs als mögliche Zellquelle16,17, da sie Eigenschaften des parodontalen Bandes erben. In dieser Hinsicht fördern hPDLSCs die Sehnenregeneration im subkutanen Implantationsmodell besser als gingivale Stammzellen und aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen18. Darüber hinaus zeigen hPDLSCs ein hohes Maß an Wirksamkeit bei der Osteogenese19. Die Differenzierung von hPDLSC zur osteogenen Abstammungslinie kann durch verschiedene Faktoren gesteuert werden, darunter Biomoleküle und mechanische Stimulation5,20.

Centella Asiatica, ein Kraut aus der Familie der Doldenblütler, wird häufig in der traditionellen Medizin verwendet. Zu den aus dieser Pflanze isolierten biologisch aktiven Molekülen gehören Terpenoide, Flavonoide, Vitamin C und Vitamin A21. Es ist bekannt, dass Centella-Extrakte pentazyklische Triterpenoidmoleküle sind, nämlich Asiatinsäure (AA) und Asiaticosid22. AA und Asiaticosid besitzen viele pharmakologische Eigenschaften, wie z. B. entzündungshemmende, antimikrobielle, antioxidative, antidiabetische und wundheilungsfördernde Eigenschaften23,24,25,26,27. Frühere Studien zeigen, dass Centella-Extrakte eine Rolle bei der Knochengewebezüchtung spielen und die Kollagensynthese in vitro und in vivo induzieren24,28,29. Asiaticosid kann die Synthese von Kollagen Typ I fördern und die osteogene Differenzierung in menschlichen Stromazellen des parodontalen Bandes induzieren30. Die hydrolytische Spaltung von Asiaticosid zu AA nach der Zellinternalisierung wurde aufgrund seiner biologischen Leistungen vorgeschlagen30,31,32,33. Darüber hinaus kann der Osteoklastogeneseprozess in vitro durch die Behandlung mit AA34 gehemmt werden. Wenn man diese Beweise zusammennimmt, könnte AA bei der Regeneration des parodontalen Gewebes und der osteogenen Differenzierung von Nutzen sein.

Die geringe Wasserlöslichkeit von AA schränkt seine klinische Anwendung ein28,35,36, da die hohe wirksame Dosis zu inakzeptablen Mengen an organischen Lösungsmitteln und Tensiden führt37. Darüber hinaus ist die Bioverfügbarkeit von AA aufgrund der schnellen Metabolisierung nach Bolusverabreichung gering38. Daher ist ein geeignetes Abgabesystem zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit erforderlich39. Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit und zur Erzielung einer hohen Wirksamkeit von AA ist die Derivatisierung40. Es wurde festgestellt, dass AA-Derivate die biologischen Aktivitäten steigern. Beispielsweise zeigten die AA-Derivate, deren C-28-Position durch eine Aminosäure und eine Acetylierung an den C-2-, C-3- und C-23-Positionen ersetzt wurde, eine erhöhte Aktivität bei der Stickoxidhemmung und entzündungshemmenden Wirkung Aktivitäten40,41 Darüber hinaus wurde die Antikrebsaktivität von AA-Verbindungen durch die Substitution von Carbonyl- und Amidbindungen an den Positionen C-11 und C-28 verbessert42. Die Substitution einer Amidgruppe an C-28 und dreier Hydroxylgruppen an C-2, C-3 und C-23 führte zu einer deutlichen Verbesserung der antiproliferativen Aktivität im Vergleich zu AA43. Antikrebsaktivität tritt auf, weil der lipophile Effekt an der C-28-Position zunimmt und polare Gruppen an den C-2-, C-3- und C-23-Positionen substituiert sind44. Eine andere Studie zeigte, dass die Antikrebsaktivität fluorierter AA-Derivate eine Folge der Fluorsubstitution ist, die die chemische und metabolische Stabilität verbessert45. Darüber hinaus verbessert die Fluoridsubstitution die Lipidlöslichkeit, Membranpermeabilität und Bindungsaffinität von AA-Derivaten46,47. Allerdings wurden AA-Derivate noch nicht gründlich auf ihre osteogene Aktivität untersucht.

Daher lag der Schwerpunkt dieser Studie auf der Derivatisierung von AA-Verbindungen an den Positionen C-2, C-3, C-23 und C-28. Die Zytotoxizität und die osteogene Induktionsstärke der AA-Derivate wurden ebenso untersucht wie der potenzielle Regulierungsmechanismus dieser Verbindungen, der die Knochenregeneration betrifft.

Die chemische Struktur von AA und seinen Derivaten ist in Abb. 1 dargestellt, und die 1H-NMR-Spektren sind in den Zusatzdaten, Abbildungen S1–S4, dargestellt. Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden die Hydroxylgruppen an den Positionen C-2, C-3 und C-23 von AA für die 501-Verbindung mit Acetylgruppen modifiziert. Die Verbindung 502 wurde von 501 durch Veresterung an der C-28-Position mit einer Butylkette abgeleitet, wohingegen die Dimethylaminopropylamingruppe an der C-28-Position in der Verbindung 503 verestert wurde. Die Derivatisierung der 506-Verbindung von AA wurde nur an der C-28-Position durch die Bildung einer Amidbindung mit Dimethylaminopropylamin durchgeführt.

Chemische Struktur von Asiatischer Säure (AA) und ihren Derivaten: 501, 502, 503 und 506. Die Verbindungen 501, 502 und 503 waren die hydroxylacetylierten Derivate von AA an den Positionen C-2, C-3 und C-23 (markiert). in Grün), dessen Carboxylgruppe von 502 und 503 durch eine Butylkette (in Rosa markiert) bzw. eine Dimethylaminopropylamingruppe (in Rot markiert) modifiziert wurde. Die Verbindung 506 wurde nur mit der Dimethylaminopropylamingruppe an der C-28-Position modifiziert.

Tabelle 1 zeigt den berechneten Verteilungskoeffizienten in einem Oktanol/Wasser-System (log P) und die Ergebnisse der quantitativen Löslichkeitsbewertung in Wasser bei Raumtemperatur und 37 °C. Tatsächlich wurde die Wasserlöslichkeit von AA und seinen Derivaten zunächst mithilfe der theoretischen Näherung auf http://www.molinspiration.com untersucht, und die Reihenfolge der Löslichkeit war 506 > AA > 503 > 501 > 502. Dennoch ist die Vorhersage von log P mit Molinspiration basiert typischerweise auf vorhandenen Daten und ihre Zuverlässigkeit könnte eingeschränkt sein, wenn eine Verbindung außerhalb des Anwendungsbereichs des Datensatzes liegt. Die Ergebnisse wurden durch eine experimentelle Löslichkeitsbewertung unter Verwendung einer gravimetrischen Methode bestätigt und eine ähnliche Solubilisierungsreihenfolge dieser Verbindungen ermittelt. Daraus kann geschlossen werden, dass die Acetylierung der Hydroxylgruppe von 501, 502 und 503 zu einer erheblichen Erhöhung der Hydrophobie führte, insbesondere bei 502, bei dem eine Butylkette an die Carboxylgruppe angehängt wurde. Die Amidierung der Carboxylgruppe mit Dimethylaminopropylamin von 503 und 506 verstärkte deren Hydrophilie und Ionisierung bei physiologischem pH-Wert, was zu einer Erhöhung der Wasserlöslichkeit führte. Somit zeigte die Verbindung 506 aufgrund der unmodifizierten Hydroxylgruppen und der Amidierung der Carboxylgruppen mit Dimethylaminopropylamin die höchste Wasserlöslichkeit. Verbindung 502 wurde aufgrund ihrer geringen Löslichkeit nicht für weitere Untersuchungen in Betracht gezogen.

Die isolierten Zellen waren positiv auf CD73, CD90 und CD105 gefärbt, zeigten jedoch keine CD45-Expression (Ergänzende Daten, Abbildung S5), was auf Stammzelleigenschaften schließen lässt. Darüber hinaus wurden die osteogenen Aktivitäten der isolierten Zellen von 5 Probanden anhand der ALP-Aktivität und der Kalziumablagerung bestimmt und dabei die in allgemeinem Medium und osteogenem Medium kultivierten Zellen verglichen, wie in den ergänzenden Daten, Abbildung S6 dargestellt. Es gab keinen merklichen Unterschied zwischen den von verschiedenen Probanden gewonnenen Zellen hinsichtlich der osteogenen Differenzierung.

Die Zytotoxizität von AA und seinen Derivaten bei einer Konzentration von 300 nM wurde an hPDLSCs 1 und 5 Tage lang untersucht (Abb. 2A). Am ersten Tag wurde eine signifikante Toxizität des 503-Derivats mit einer Zelllebensfähigkeit von < 40 % beobachtet, wohingegen die Zelllebensfähigkeit von AA und anderen Derivaten mehr als 90 % betrug. Allerdings war die Zelltoxizität des 501-Derivats nach längerer Exposition ausgeprägt, wobei die Lebensfähigkeit der Zellen am 5. Tag auf weniger als 75 % sank. AA und die 506-Variante zeigten bis zu 5 Tage lang keine signifikante Toxizität gegenüber hPDLSCs.

Screening der biologischen Wirkungen von AA und seinen Derivaten in einem allgemeinen Medium: (A) Lebensfähigkeit von hPDLSCs nach einer Behandlung mit 300 nM AA, 501, 503 und 506 für 1 bzw. 5 Tage (D1 bzw. D5). (B) Expression des BMP2-, RUNX2-, COL1- und WNT3A-Gens von hPDLSCs nach 24-stündiger Behandlung mit AA und seinen Derivaten. (n = 5).

Es kann vorgeschlagen werden, dass die Substitution der Triolgruppen durch eine sperrigere Acetylgruppe in den Varianten 501 und 503 zu einer erhöhten Zytotoxizität führt. Diese Ergebnisse stimmten mit früheren Studien überein48, in denen die Acetylierung der Hydroxylgruppen aufgrund der erhöhten Hydrophobie der Moleküle zu einer größeren Zytotoxizität für Kulturzellen führte, was wiederum die Fluidität der Zellmembran veränderte und zum Zelltod führte. In ähnlicher Weise haben Siewert et al. schlugen vor, dass ein Anstieg der Zelltoxizität durch AA-Derivate induziert wurde, die durch die Substitution einer Hydroxylgruppe an C-2, C-3 und lipophiler Einheiten an Position C-23 synthetisiert wurden. Die Autoren schlugen vor, dass eine lipophile Substitution die Zellpermeabilität verändern könnte, was zu einer Veränderung führte zu einem erheblichen Anstieg der Zytotoxizität44.

Um das Potenzial von AA-Derivaten bei der Osteogenese weiter zu bewerten, wurden hPDLSCs 24 Stunden lang in normalem Wachstumsmedium, ergänzt mit AA und den Derivaten, gehalten. Für das Screening-Experiment wurde die niedrigste wirksame Konzentration von AA und seinen Derivaten gewählt, die 100 nM betrug, mit Ausnahme von 10 nM für die Verbindung 503 aufgrund ihrer begrenzten Löslichkeit. Die mRNA-Expression der osteogenen Markergene BMP2, RUNX2, COL1A1 und WNT3A wurde bewertet. Konzentriert man sich auf das Expressionsniveau von BMP2 (Abb. 2B), wurde eine hohe Expression für die Verbindung 506 beobachtet, während die von AA, 501 und 503 bei allen Markern keine beobachtbare Veränderung aufwiesen.

BMP2 ist für seine wichtige Rolle bei der dauerhaften Induktion der osteogenen Differenzierung bekannt49, und ein früherer Bericht wies darauf hin, dass der Verlust von BMP2 zu einer schweren Beeinträchtigung der Osteogenese führt50. In dieser Studie reichte die Behandlung mit 100 nM 506-Verbindung aus, um die BMP2-Expression zu steigern. Im Vergleich zu anderen Studien erforderte die AA-Verbindung eine Konzentration von bis zu 20 µM, um Osteoklastogenese oder Knochenschwund zu hemmen34. Darüber hinaus induzierte eine andere Asiaticoside-Centella-Extraktverbindung die Osteogenese in hPDLSC in einer Konzentration von 10 bis 100 µM30,31, was etwa zwei bis drei Größenordnungen höher war als die getestete Konzentration für die 506-Verbindung. Dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass, ähnlich wie bei der Centella-Extraktverbindung, relativ geringe Mengen der 506-Verbindung in der Lage sind, die osteogene Differenzierung zu fördern.

Die Verbindung 506 wurde als Medikamentenkandidat ausgewählt. Die dosisabhängigen biologischen Aktivitäten der 506-Verbindung wurden im Bereich von 100 bis 300 nM bewertet. Am ersten Tag nach der Exposition zeigte die Expression des BMP2-Gens (Abb. 3A) ein erhöhtes Transkriptniveau bei den niedrigeren Konzentrationen (100 und 200 nM). Im Gegensatz dazu zeigte die Proteinexpression einen dosisabhängigen Anstieg (Abb. 3B).

Die Auswirkungen von Verbindung 506 in einem allgemeinen Medium wurden untersucht auf: (A) BMP2-Genexpression, bestimmt durch quantitative RT-PCR, (B) BMP2-Proteinexpression, bestimmt durch ELISA auf D1 und D3 und (C) ALP-Aktivität der damit behandelten hPDLSCs unterschiedliche Konzentrationen (100, 200 und 300 nM) an D3, die auf das gesamte Zellprotein normalisiert wurden. Die Sternchen (*, **, ***, ****) geben die statistischen Unterschiede bei p-Wert ≤ 0,05, 0,005, 0,0005 bzw. 0,0001 an. (n = 5).

Typischerweise kann eine Diskrepanz zwischen dem mRNA-Transkriptniveau und der damit verbundenen Proteinexpression beobachtet werden. Da die zelluläre Maschinerie dynamisch ist und mehrere Schritte umfasst, kann eine zeitlich abhängige Produktion oder ein zeitlich abhängiger Abbau von mRNA und dem zugehörigen Protein zu einer nichtharmonischen Expression von Genen und Proteinen führen51. Möglicherweise könnten 300 nM der Verbindung 506 auch eine hohe Expression des BMP2-Gens induzieren, das zu einem frühen Zeitpunkt schnell translatiert wurde, was zu einem niedrigen Transkriptniveau bei hoher Proteinexpression führte52. Tatsächlich ist bekannt, dass eine frühe Expression des BMP2-Proteins in einem kurzen Zeitraum für die osteogene Induktion ausreichend ist. In früheren Studien wurde berichtet, dass vom Menschen stammende mesenchymale Stammzellen, die nur 15 Minuten lang mit rekombinantem menschlichem BMP2-Protein behandelt wurden, in die osteogene Linie differenzieren können53,54.

Aus Abb. 3C geht ein dosisabhängiger Anstieg der Aktivität von ALP, einem frühen Marker des osteogenen Prozesses und der Zelldifferenzierung, hervor. 55, 56 Es wird vermutet, dass der erhöhte ALP-Spiegel ein nachgeschalteter Prozess der BMP2-Stimulation durch Verbindung 506 ist, wie die Studie von Harada et al.57 belegt, die den Zusammenhang zwischen dem BMP2-Signalprozess und der ALP-Aktivität aufdeckte.

Typischerweise besteht die osteogene Differenzierung aus drei Stadien; (1) Zellproliferation, (2) extrazelluläre Matrixablagerung und (3) Matrixmineralisierung58. Die präosteogenen Marker von hPDLSCs wurden unter Verwendung der 506-Verbindung in einer Konzentration von 300 nM untersucht (Abb. 4). RUNX2 ist ein potenzieller Transkriptionsfaktor für die Zellproliferation und die Steuerung der osteogenen Bindung57. Es fungiert auch als Transkriptionsfaktor verschiedener präosteogener Marker wie ALP, IBSP, OSX und COL1A158. Es fehlt ihm jedoch die Fähigkeit, die COL1A1-Expression im reifen Osteoblasten aufrechtzuerhalten59. Unsere Ergebnisse zeigten keine beobachtbare Veränderung der RUNX2- und COL1A1-Expressionsniveaus nach der Behandlung mit der 506-Verbindung an beiden Tagen 1 und 3 (Abb. 4A, G). Das Ergebnis ähnelte einer früheren Studie, die zeigte, dass eine kurzzeitige Behandlung mit BMP2-stimulierenden Medikamenten die RUNX2-Expression nicht steigern kann53. Obwohl das Expressionsniveau anderer osteogener Faktoren wie BMP2, IBSP, ALP und OSX im Vergleich zu den Kontrollniveaus erhöht war (Abb. 4B, D–F). Vermutlich förderte die 506-Verbindung die osteogene Differenzierung von hPDLSCs über einen von RUNX2 unabhängigen Weg.

Die Expression von (A) RUNX2, (B) BMP2, (C) WNT3A, (D) IBSP, (E) ALP, (F) OSX und (G) COL1A1 von hPDLSCs, die 1 und 3 Tage lang mit 300 nM 506 behandelt wurden ( D1 und D3) in einem allgemeinen Medium wurden durch quantitative RT-PCR bestimmt. Die gepunktete Linie stellt ein Expressionsverhältnis von 1 als Kontrolle dar. Das „ns“ weist auf einen nichtstatistischen Unterschied hin. Die Sternchen (*, **, ***, ****) geben die statistischen Unterschiede bei p-Wert ≤ 0,05, 0,005, 0,0005 bzw. 0,0001 an. (n = 5).

Um andere mögliche osteogene Induktionswege der 506-Verbindung zu untersuchen, wurde das Expressionsniveau von WNT3A bestimmt, da bekannt ist, dass der kanonische WNT/β-Catenin-Weg die osteogene Differenzierung30 durch Zusammenarbeit mit dem BMP2-Signalweg60 fördert. Am dritten Tag nach der Behandlung mit 506 Verbindungen wurde ein erhöhter Transkriptspiegel von WNT3A festgestellt (Abb. 4C). Am Tag 1 wurde eine hohe Expression von BMP2 beobachtet, bevor sie am Tag 3 auf ein Kontrollniveau abfiel (Abb. 4B), während am Tag 3 ein Anstieg von WNT3A beobachtet wurde (Abb. 4C). Dies könnte darauf hindeuten, dass die BMP2-Genexpression durch die 506-Verbindung gefördert wird. Anschließend förderte BMP2 kontinuierlich WNT3A. Wir haben gezeigt, dass die Verbindung 506 die WNT3A-Expression deutlich fördert. Die Ergebnisse stimmten mit früheren Studien überein, wonach Asiaticosid die Wnt-Aktivität fördert, indem es die Osteogenese von hPDLSCs30 oder die Wundheilungseigenschaften in Tiermodellen steigert49,61.

Um die osteogene Induktion der 506-Verbindung zu bestätigen, wurden hPDLSCs 14 Tage lang kultiviert und eine Von-Kossa- und Alizarinrot-S-Färbung der Kalziumablagerung durchgeführt (Abb. 5). Im Vergleich zur Positivkontrolle förderte die 506-Verbindung die Gewebemineralisierung in einem Ausmaß, das mit den gleichen Zellen vergleichbar war, die in einem osteogenen Medium kultiviert wurden, was eine potenzielle osteogene Eigenschaft der 506-Verbindung bestätigte.

Von-Kossa- (oben) und Alizarinrot-S-Färbung (unten) zur Kalziumablagerung von hPDLSCs, die unter verschiedenen Bedingungen (mit oder ohne 300 nM 506, im allgemeinen Medium und im osteogenen Medium) 14 Tage lang kultiviert wurden. Der Einschub der Alizarin Red S-Färbungsbilder zeigt die gesamte gefärbte Zelle in der kultivierten Wellplatte. Dunkelgraue Färbung und rote oder dunkelrote Färbung weisen auf eine Zellmineralisierung bei Von-Kossa- bzw. Alizarin-Rot-S-Färbung hin. (Maßstabsbalken für Von-Kossa-Färbung = 10 mm, Maßstabsbalken für Alizarinrot-S-Färbung = 10 mm (Einschub) 100 µm (Vollbild)).

Zusätzlich zur Untersuchung möglicher Wege der osteogenen Induktion von 506 über BMP2- und WNT3A-Signale wurde die Osteogenese über den MAPK/Erk-Signalweg mithilfe einer Hemmung von Erk mit der damit verbundenen Expression von BMP2 und WNT3A bestimmt (Abb. 6). Die BMP2-Expression, wenn die Zellen nach einer Hemmung von Signalmolekülen, z. B. ERK, FAK, PI3K und DKK1, mit der 506-Verbindung behandelt wurden, wurde in den ergänzenden Daten, Abbildung S7, gezeigt. Alle diese Inhibitoren wurden aufgrund ihrer Funktionen ausgewählt, die die Neuordnung der Zytoskelettstruktur62,63,64 und die Modulation von ECM-Proteinen65 umfassen, die am osteogenen Differenzierungsprozess beteiligt sind. ERK ist ein wichtiges Signalmolekül bei der Modulation von ECM-Proteinen, das die Zelldifferenzierung in die osteogene Linie fördern kann. FAK kann den RUNX2-Transkriptionsfaktor65 aktivieren und stimulieren. PI3K ist ein Signal, das an der Osteoporosehemmung66, der Knochenhomöostase und der Entwicklung des Zytoskeletts67 beteiligt ist. DKK1 ist ein Inhibitor des kanonischen WNT/β-Catenin-Signalwegs68. Das Ergebnis zeigte, dass nur eine Hemmung der ERK-Signalmoleküle die BMP2-Expression auf ein ähnliches Niveau wie die unbehandelten Zellen hemmen kann. Auch die Expression von WNT3A wurde durch die Anwendung des Erk-Inhibitors gehemmt. Daher wird vorgeschlagen, dass der Erk-Signalweg der Mechanismus ist, durch den die 506-Verbindung die osteogene Differenzierung von hPDLSCs reguliert. Es ist bekannt, dass BMP2 über verschiedene Signalwege gesteuert werden kann, beispielsweise MAPK/Erk, Hedgehog, Notch und Wnt69,70. Erk, das über den MAPK-Weg reguliert wird, ist für seine wesentliche Rolle bei der osteogenen Differenzierung und Zellproliferation bekannt71. Der Zusammenhang zwischen dem Expressionsniveau von BMP2 und dem MAPK/Erk-Signalweg wurde bereits zuvor aufgeklärt72. Die Hemmung von Erk1/2 kann die Expression von BMP2 herunterregulieren und die ALP-Aktivität verringern52,62. Es wurde ein Übersprechen zwischen dem kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und dem MAPK/Erk-Signalweg beobachtet, wobei das β-Catenin den Abbau von Ras verhindert, einem nachgeschalteten Signalprotein des MAPK-Signalwegs73. Es ist möglich, dass die 506-Verbindung die Aktivität von BMP2 oder WNT3A induziert oder verstärkt und damit den Downstream-Prozess beeinflusst, einschließlich des kanonischen β-Catenin-Signalwegs, sodass anschließend der MAPK-Signalweg induziert und die höhere Expression osteogener Faktoren stimuliert wird.

Die relative Expression von (A) BMP2 und (B) WNT3A von hPDLSCs, die mit 300 nM 506 mit oder ohne Erk-Inhibitor in einem allgemeinen Medium behandelt wurden, wurde untersucht. Die Sternchen (*, **) geben die statistischen Unterschiede bei p-Wert ≤ 0,05 bzw. 0,005 an. (n = 5).

Die vorliegende Studie zeigte, dass es sich bei der Verbindung 506 um einen Medikamentenkandidaten handelt, der die osteogene Differenzierung fördert und im Vergleich zu AA und anderen Derivaten eine relativ hohe Wasserlöslichkeit und geringe Zytotoxizität aufweist. Die Mineralisierung der extrazellulären Matrix von hPDLSCs wurde innerhalb einer Woche ohne osteogene Ergänzung beobachtet. Die osteogenen Genmarker BMP2, WNT3A und OSX wurden hochreguliert und die BMP2-Proteinexpression verstärkt. Es ist möglich, dass die 506-Verbindung das Transkript von BMP2 über den Erk-Signalweg stimuliert, der über den Wnt-Weg reguliert wird, und nicht über RUNX2.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Ersatz der Carboxylgruppen von AA durch Dimethylaminopropylamin zu osteogenen Induktionsfähigkeiten führte, sodass diese Derivate für den Einsatz in der regenerativen Medizin geeignet sein könnten.

Die Derivate von AA, 501, 502, 503 und 506 wurden aus AA und Asiaticoside synthetisiert und derivatisiert. Die chemischen Strukturen von AA und seinen Derivaten sowie das 1H-NMR sind in Abb. 1 und den ergänzenden Daten, Abbildungen S1–S4, dargestellt. Alle Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden von Sigma-Aldrich (Burlington, MA, USA) oder Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) gekauft, sofern nicht anders angegeben.

AA (5 g, 10,23 mmol) wurde in einen 100-ml-Rundkolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von Pyridin (4,0 g, 51,2 mmol), Essigsäureanhydrid (7,3 g, 71,6 mmol) und n-(4-Pyridyl)-Dimethylamin (249,9 mg, 2,0 mmol). Die Reaktion wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat gelöst, dann mit 1 N Hydrochlorid und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde unter Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Produkt 501 zu erzeugen. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,26 (s, 1H), 5,15–5,21 (m, 1H), 5,10 ( d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 3,60 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 2,21 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 2,15 – 1,60 ( m, 20H), 1,59 – 1,22 (m, 9H), 1,12 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6,0 Hz, 4H), 0,90 (s, 3H), 0,87 (d , J = 6,0 Hz, 3H), 0,79 (s, 3H).

501 (2,0 g, 3,25 mmol), DCM (10 ml), N1, N1-Dimethylpropan-1,3-diamin (664,8 mg, 6,51 mmol), HOBt (1,0 g, 7,81 mmol) und EDCl (1,5 g, 7,81 mmol). ) wurden in einen 100-mL-Rundkolben gegeben. Die Reaktion wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Ethylacetat gelöst, dann mit Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde unter Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Produkt 503 zu erzeugen. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,97 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 5,34 (s, 1H) , 5,18 (td, J = 10,9, 4,5 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,86 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 3,59 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 3,54 – 3,38 (m, 2H), 3,15 (dd, J = 13,6, 5,0 Hz, 1H), 2,68 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 2,52 (s, 6H), 2,13 – 2,06 (m, 1H ), 2,10 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,04 – 1,95 (m, 7H), 1,91 – 1,60 (m, 6H), 1,56 – 1,22 (m, 11H), 1,12 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,90–0,86 (m, 6H), 0,77 (d, J = 8,6 Hz, 3H).

503 (1 g, 1,43 mmol) wurde in einen 100-ml-Rundkolben gegeben, gefolgt von THF (5 ml), Wasser (5 ml) und LiOH (1 g, 42,92 mmol). Die Reaktion wurde 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Vakuum eingeengt, um THF zu entfernen. Der Rückstand wurde mit DCM extrahiert und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde unter Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Produkt 506 zu erzeugen. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 5,37 (t, J = 3,2 Hz, 1H), 3,72 (td, J = 11,2, 4,4 Hz, 1H), 3,50 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,38 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,33 (dt, J = 3,2, 1,6 Hz, 2H), 3,31–3,25 ( m, 3H), 3,18 (dd, J = 13,0, 7,4 Hz, 1H), 3,07 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,87 (s, 6H), 2,20–1,29 (m, 21H), 1,16 (s , 3H), 1,06 (s, 3H), 0,99 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,81 (s, 3H), 0,71 (s, 3H).

501 (2,0 g, 3,25 mmol), DCM (10 ml), n-Butanol (241,1 mg, 3,25 mmol), DMAP (476,1 mg, 3,90 mmol) und EDCI (783,1 mg, 3,90 mmol) wurden zu einem 100-ml-Rund gegeben unterer Kolben. Die Reaktion wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Ethylacetat gelöst, dann mit Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde unter Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Produkt 502 zu erzeugen. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,25 (s, 1H), 5,16 (dd, J = 10,9, 4,4 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 4,08–3,92 (m, 2H), 3,86 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 3,58 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 2,25 ( d, J = 11,2 Hz, 1H), 2,10 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,98 – 1,91 (m, 2H), 1,86 – 1,24 (m, 22H), 1,12 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 0,98–0,91 (m, 6H), 0,90 (s, 3H), 0,86 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,77 (s, 3H).

Zunächst wurde die Stammlösung von AA und seinen Derivaten in DMSO aus 100 μM hergestellt und seriell auf 1 nM verdünnt. Später wurden AA-Derivate in DMSO in ihrer höchsten löslichen Konzentration als Stammlösung hergestellt, bevor sie bei Verwendung mit einem Kulturmedium auf die Arbeitskonzentration verdünnt wurden.

Die Wasserlöslichkeit von AA und seinen Derivaten wurde mithilfe einer gravimetrischen Methode überprüft. Kurz gesagt, AA und die Derivate wurden in einer überschüssigen Menge in hochreinem Wasser gelöst und die Proben wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur und 37 °C geschüttelt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert, um die ungelösten Verbindungen abzutrennen. Anschließend wurde das spezifische Volumen der Überstände gesammelt und lyophilisiert. Der verbleibende Feststoff nach der Lyophilisierung wurde mit einer 7-stelligen Waage (XPR2u, Mettler Toledo, OH, USA) gewogen und die maximale Löslichkeit in Wasser bei den unterschiedlichen Temperaturen wurde basierend auf dem Volumen der gesammelten Lösung der Verbindungen berechnet. Das Experiment wurde in vierfacher Ausführung durchgeführt.

Die Zellen wurden von gesunden Freiwilligen entnommen, bei denen gemäß ihrem Behandlungsplan an der Fakultät für Zahnmedizin der Chulalongkorn-Universität, Thailand, eine chirurgische Entfernung des dritten Molaren vorgesehen war. Diese Forschung wurde vom Human Research Ethics Committee der Fakultät für Zahnmedizin der Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand genehmigt (HREC-DCU 2020-090, Datum der Genehmigung: 02. Oktober 2020). Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien/Vorschriften durchgeführt und eine Einverständniserklärung wurde eingeholt. Die hPDLSCs wurden nach einem etablierten Protokoll30 explantiert und kultiviert. Die vom Probanden stammenden Zähne wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und das parodontale Bandgewebe wurde aus der Zahnwurzel extrahiert. Das isolierte Gewebe wurde in Dulbeccos Modified Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum enthielt. Die Stammzelleneigenschaften der isolierten Zellen wurden durch eine Antikörperfärbung für Stammzellmarker bestätigt, nämlich CD73 (Kat.-Nr. 212270733, ImmunoTools, Friesoythe, Deutschland), CD90 (Kat.-Nr. ab11155, Abcam, Cambridge, UK) und CD105 (Kat.-Nr. 21271054, ImmunoTools, Friesoythe, Deutschland) und der hämatopoetische Stammzellmarker CD45 (Kat.-Nr. 21810455, ImmunoTools, Friesoythe, Deutschland). Die Expression von Oberflächenproteinen wurde mittels Durchflusszytometrieanalyse nachgewiesen.

Stammlösungen von AA, 501, 502, 503 und 506 wurden in DMSO in einer Konzentration von 100 µM hergestellt und anschließend im Kulturmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Exposition gegenüber den Arzneimitteln wurde mithilfe eines PrestoBlue™-Resazurin-Assays gemäß dem Protokoll des Herstellers untersucht. Zellen mit einer Dichte von 60.000 Zellen/Well wurden in 24-Well-Platten ausplattiert und 24 Stunden lang in einem normalen Wachstumsmedium kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit 300 nM AA und Lösungen von 501, 502, 503 und 506 behandelt. Nach 24-stündiger und 5-tägiger Inkubation wurden die Kulturen mit Resazurin-Arbeitslösung behandelt und die Fluoreszenzintensität bei einer Emissionswellenlänge von gemessen 590 nm wurden bei Anregung mit einer Wellenlänge von 560 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Synergy H1, Biotek Multimode-Lesegerät, Winooski, VT, USA) gemessen. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen und das Experiment wurde an verschiedenen Zelllinien von mindestens fünf Spendern durchgeführt.

Die Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 60.000 Zellen/Well ausgesät und mit AA oder den Derivaten in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Die Medien wurden jeden zweiten Tag gewechselt, um die kontinuierliche Aktivität von AA-Derivaten sicherzustellen. Für Erk-Inhibitionsexperimente wurden die Zellen vor der Behandlung mit AA-Derivaten 2 Stunden lang mit 2,5 nM Erk-Inhibitor (Kat.-Nr. 328006, Calbiochem, San Diego, CA, USA) vorbehandelt. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Gesamt-RNA mit TRIzol®-Reagenz gemäß dem Standardprotokoll extrahiert und der RNA-Gehalt und die Reinheit mit einem Mikrovolumenspektrophotometer (NanoDrop™ One, Thermo Fisher Scientific, USA) gemessen. Anschließend wurde 1 μg der RNA-Probe unter Verwendung des Reverse-Transkriptionssystems Improm II (Promega, USA) revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Das Transkriptniveau der Zielgene ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die Expressionsniveaus der Zielgene wurden durch Echtzeit-Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des SYBR-Grün-Detektionssystems (FastStart Essential DNA Green Master, Roche Diagnostics, Schweiz) auf dem MiniOpticon nachgewiesen ™ RT-PCR-System (Bio-Rad, USA). Die quantitative RT-PCR wurde mit einem LightCycler® 96 (Roche Diagnostics, Schweiz) durchgeführt. Als interne Kontrolle wurde die Transkriptexpression von GAPDH verwendet. Die relative Genexpressionsanalyse wurde mit der CFX Manager-Software (Bio-Rad, USA) durchgeführt. Der Expressionswert wurde unter Verwendung eines Expressionswerts des zellulären Housekeeping-Gens GAPDH normalisiert und die Kontrolle wurde für jeden jeweiligen Tag berücksichtigt.

Die Expressionsniveaus der Zielproteine ​​wurden durch einen Sandwich-ELISA-Assay analysiert. Zunächst wurden die Zellen lysiert und die Proteinmenge mit einem Bio-Rad BCA-Proteintestkit (Bio-Rad Laboratories, USA) analysiert. Gemäß dem Standardprotokoll wurden die Zielproteine ​​​​mit einem ELISA-Kit (R&D Systems, USA) analysiert.

Zu den festgelegten Zeitpunkten wurde die ALP-Aktivität gemessen. Mit unterschiedlichen Konzentrationen an AA-Derivaten behandelte Zellen wurden gesammelt, mit PBS gewaschen und mit alkalischem Lysepuffer lysiert. Das Zelllysat wurde mit einer Mischung inkubiert, die 2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, 0,1 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol und 2 mM MgCl2 enthielt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 mM NaOH beendet. Die Absorption bei 410 nm wurde gemessen und die quantitativen Daten wurden mit der Menge des gesamten zellulären Proteins normalisiert.

Die In-vitro-Mineralisierung wurde nach Calciumfärbung mit der Von-Kossa-Methode und Alizarinrot-S-Färbung nach einem etablierten Protokoll sichtbar gemacht74. Kurz gesagt, am 14. Tag wurden die Zellen gewaschen und 10 Minuten lang mit kaltem Methanol fixiert, bevor sie mit entionisiertem Wasser gespült wurden. Die Von-Kossa-Färbung erfolgte durch 30-minütige Behandlung der fixierten Zellen mit 5 % w/v Silbernitratlösung. Für die Alizarin Red S-Färbung wurde die Alizarin Red S-Lösung (0,5 % w/v, pH 4,2) mit den fixierten Zellen 5 Minuten lang inkubiert. Die Bildung mineralisierter Knötchen wurde unter einem Phasenkontrastmikroskop (Nikon ECLIPSE Ts2, Nikon, USA) beobachtet. Als Negativkontrolle wurden in einem normalen Wachstumsmedium kultivierte Zellen verwendet. Die in einem osteogenen Medium (DMEM, ergänzt mit 50 mg/ml Ascorbinsäure, 100 nM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphat) kultivierten Zellen wurden als Positivkontrolle angesehen.

Die Daten wurden als Boxplot-Diagramm dargestellt. Die Mitte des Boxplots zeigt Mediandaten an, während der untere und obere Rand des Boxplots die Werte des 1. bzw. 3. Quartils anzeigen. Es wurden Zellen von mindestens vier verschiedenen Spendern verwendet. Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Analyse unter Verwendung von Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Die Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert ≤ 0,05 war.

Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Alle Zellen in dieser Studie wurden von gesunden Patienten entnommen, bei denen gemäß ihrem Behandlungsplan an der Fakultät für Zahnmedizin der Chulalongkorn-Universität, Thailand, eine chirurgische Entfernung des dritten Molaren geplant war. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Human Research Ethics Committee der Fakultät für Zahnmedizin der Chulalongkorn-Universität, Bangkok, Thailand genehmigt (HREC-DCU 2020-090, Datum der Genehmigung: 2. Oktober 2020). . Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien/Vorschriften durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Asiatische Säure

Alkalische Phosphatase

Bicinchoninsäure

Knochenmorphogenetisches Protein 2

Das britische Arzneibuch

Kollagen Typ I Alpha1

Dichlormethan

Dickkopf WNT-Signalweg-Inhibitor 1

4-(Dimethylamino)pyridin

Dimethylsulfoxid

Desoxyribonukleinsäure

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Extrazelluläre signalregulierte Kinase

Fokale Adhäsionskinase

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

Stammzellen des menschlichen parodontalen Bandes

Integrin-bindendes Sialoprotein

Hydroxybenzotriazol

Lithiumhydroxid

Osterix

Phosphatidylinositol-3-Kinase

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

Ribonukleinsäure

Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2

Tetrahydrofuran

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Referenzen herunterladen

Die vorliegende Studie wurde von der Program Management Unit for Competitiveness, Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (Fördernummer: CU_FRB640001_01_30_10; PP und JAL) und dem Second Century Fund (C2F) der Chulalongkorn University (ST und JAL) unterstützt. . Die Autoren danken Alan Rogerson für das Korrekturlesen des Artikels. Die Autoren danken Assoc. Prof. Sornkanok Vimolmangkang und Frau Khwanlada Kobtrakul für ihren Vorschlag zum Löslichkeitsscreening-Experiment. Schließlich ist dieses Werk dem Andenken des verstorbenen Prof. Prasit Pavasant, unseres geliebten Lehrers, gewidmet. Ohne seine großartige Unterstützung wäre es nicht zustande gekommen.

Abteilung für Pharmazeutik und industrielle Pharmazie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Sirikool Thamnium, Chavee Laomeephol und Jittima A. Luckanagul

Kompetenzzentrum für Biomaterialtechnik in Medizin und Gesundheit, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Chavee Laomeephol & Jittima A. Luckanagul

Kompetenzzentrum für regenerative Zahnheilkunde, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Fragen Sie Pavasant

Abteilung für Anatomie, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Prasit Pavasant & Thanaphum Osathanon

Forschungseinheit für zahnmedizinische Stammzellbiologie, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Thanaphum Osathanon

Labor für Biomaterialien, Institut für Lebens- und Medizinwissenschaften, Universität Kyoto, 53 Kawara-cho, Shogoin, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8507, Japan

Yasuhiko Tabata

Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, PO Box 416, Chengdu, 6100641, Sichuan, Volksrepublik China

Chao Wang

School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu, 610039, Volksrepublik China

Chao Wang

Kompetenzzentrum für pflanzenproduzierte Arzneimittel, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Jittima A. Luckanagul

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ST: Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Datenkuration, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf, CL: Validierung, formale Analyse, Datenkuration, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf, PP: Methodik, Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Validierung, Datenkuration , Untersuchung, Supervision, Supervision, Projektverwaltung, Finanzierungsbeschaffung, TO: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision, Projektverwaltung, CW: Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision, Projektverwaltung, YT: Ressourcen , Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Projektverwaltung, JAL: Konzeptualisierung, Validierung, Ressourcen, Datenkuration, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungsakquise.

Korrespondenz mit Jittima A. Luckanagul.

JAL ist Mitbegründer, Anteilseigner und Berater von Nabsolute Co., Ltd., Bangkok, Thailand. Bei den übrigen Autoren besteht kein Interessenkonflikt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Thamnium, S., Laomeephol, C., Pavasant, P. et al. Osteogene Induktion von asiatischen Säurederivaten in menschlichen Stammzellen des parodontalen Bandes. Sci Rep 13, 14102 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41388-8

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Eingegangen: 5. Januar 2023

Angenommen: 25. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41388-8

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