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Jun 12, 2023

Peptid-Nukleinsäure

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14222 (2023) Diesen Artikel zitieren 1 Details zu Altmetric Metrics Ideale Arzneimittelträger verfügen über eine hohe Ladekapazität, um die Exposition von Patienten zu minimieren

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14222 (2023) Diesen Artikel zitieren

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Ideale Arzneimittelträger zeichnen sich durch eine hohe Beladungskapazität aus, um die Belastung von Patienten durch überschüssige, inaktive Trägermaterialien zu minimieren. Die höchstmögliche Beladungskapazität könnte durch Nanoträger erreicht werden, die aus den therapeutischen Ladungsmolekülen selbst zusammengesetzt sind. Hier beschreiben wir auf Peptidnukleinsäure (PNA) basierende Zirkonium (Zr)-Koordinationsnanopartikel, die eine sehr hohe PNA-Beladung von \(>\,94\%\) w/w aufweisen. Diese metallorganische Hybrid-Nanomaterialklasse erweitert den enormen Verbindungsraum von Koordinationspolymeren hin zu bioaktiven Oligonukleotid-Linkern. Die Architektur einzel- oder doppelsträngiger PNAs wurde systematisch variiert, um Designkriterien für die koordinationsgesteuerte Selbstorganisation mit Zr(IV)-Knoten bei Raumtemperatur zu identifizieren. Aromatische Carbonsäurefunktionen, die als Lewis-Basen dienen, und ein zweistufiger Syntheseprozess mit Präformation von \(Zr_{6} O_{4} (OH)_{4}\) erwiesen sich als entscheidend für den erfolgreichen Aufbau von Nanopartikeln. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bestätigte, dass die PNA-Zr-Nanopartikel leicht von Zellen internalisiert werden. Mit einem kationischen Lipopeptid beschichtete PNA-Zr-Nanopartikel lieferten erfolgreich eine Antisense-PNA-Sequenz zur Spleißkorrektur der \(\beta\)-Globin-Intronmutation IVS2-705 in eine funktionelle Reporterzelllinie und vermittelten Spleißwechsel über Interaktion mit der endogene mRNA-Spleißmaschinerie. Die vorgestellten PNA-Zr-Nanopartikel stellen eine bioaktive Plattform mit hoher Designflexibilität und außergewöhnlicher PNA-Beladungskapazität dar, bei der die Nukleinsäure einen integralen Bestandteil des Materials darstellt und nicht in passive Abgabesysteme geladen wird.

Metallorganische Gerüste (MOFs) sind anorganisch-organische Hybridmaterialien, die aus Metallionen oder Metallclustern und organischen Linkern mit Lewis-Base-Funktionen bestehen. Die koordinationsgesteuerte Selbstorganisation der organischen Linker und Metallknoten führt zur Bildung hochgeordneter, in vielen Fällen poröser, zwei- oder dreidimensionaler Gerüste1,2. Obwohl es sich bei MOFs überwiegend um kristalline Strukturen handelt, wird in der Literatur auch über nichtkristalline MOFs wie amorphe MOFs, MOF-Flüssigkeiten, MOF-Gläser und andere Koordinationspolymere berichtet3. Die vielseitige Montagestrategie ermöglicht die Schaffung hybrider Materialien mit vielfältigen Eigenschaften durch Auswahl geeigneter Baueinheiten4. Diese Designflexibilität schafft einen enormen Verbindungsraum mit einer großen Anzahl generierter MOFs und Koordinationspolymere für verschiedene Zwecke5,6,7,8. Im Zusammenhang mit biomedizinischen Anwendungen wurden MOFs und Koordinationspolymere als Träger für kleine molekulare Arzneimittel oder Biomoleküle sowie als Gerüste mit fotosensibilisierenden, strahlungsverstärkenden und biobildgebenden Eigenschaften entwickelt9,10,11,12,13,14, 15,16,17. UiO-66, aufgebaut aus sechskernigen Zirkoniumoxidclustern \((Zr_6 O_4 (OH)_4)\) und Terephthalsäure (TPA), gehört zu den am intensivsten erforschten MOFs18,19. Aufgrund der unkomplizierten Synthese, der außergewöhnlichen Stabilität und der sehr großen Oberfläche wurden UiO-66 und Derivate häufig auch für die Verwendung als Arzneimittelträger geprüft20. Ein allgemein kritischer Parameter für die Anwendung von Nanopharmazeutika ist die potenzielle Toxizität des Materials. Bei MOFs müssen die Verträglichkeit der einzelnen Komponenten sowie die Nanotoxizität der zusammengesetzten Partikel berücksichtigt werden21. Zr kommt in biologischen Systemen vor und weist eine mäßig geringe Toxizität auf, wie in histologischen und zytologischen Studien festgestellt wurde22. Zr-basierte MOFs weisen im Allgemeinen eine geringe Toxizität in Bezug auf die Metallkomponente auf, obwohl der Grad der Biokompatibilität je nach organischen Linkerkomponenten und einzelnen Strukturen variieren kann23,24. Eine Strategie zur Überwindung einiger Toxizitätsprobleme ist die Verwendung gut verträglicher endogener organischer Liganden wie Aminosäuren25,26,27, Peptide28,29,30, Proteine31,32 oder Nukleobasen33,34 zur Erzeugung von „Bio-MOFs“35. 36. Doch auch bei gut verträglichen Nanomaterialien ist eine hohe Wirkstoffbeladungskapazität und eine minimale Exposition der Patienten gegenüber übermäßigem Trägermaterial von Vorteil, um Nebenwirkungen zu verhindern. Theoretisch könnte die maximale Wirkstoffbeladung durch Nanomaterialien erreicht werden, die von den bioaktiven Einheiten selbst gebildet werden. Metallorganische Nanopharmazeutika, die aus Arzneimittelmolekülen mit Lewis-Base-Funktionen aufgebaut sind, die sich mit Metallionen zu Koordinationsnanopartikeln zusammenfügen, ähneln in etwa den vorgesehenen Nanoträgern mit maximaler Beladungskapazität37,38. Während dieses Konzept bereits mit Therapeutika mit niedrigem Molekulargewicht umgesetzt wurde39,40,41,42, wurde nicht über Koordinationspolymere berichtet, die Linker auf Basis bioaktiver Biomoleküle oder synthetischer Analoga enthalten.

Zuvor berichtete Strategien zur Erzeugung nukleinsäurehaltiger MOFs basierten meist auf der Bindung an interne oder externe MOF-Oberflächen und der Biomineralisierung während des MOF-Zusammenbaus. Sowohl kovalente als auch nichtkovalente Wechselwirkungen wurden verwendet, um MOFs mit Oligonukleotiden zu funktionalisieren43. Beispielsweise wurde das Zirkonium-MOF UiO-66-N3, das organische Linker mit Azidogruppen enthält, über eine spannungsgeförderte Klickreaktion kovalent mit Dibenzocyclooctin (DBCO) modifizierten DNA-Oligonukleotiden funktionalisiert. Darüber hinaus wurde UiO-68 mit Aminotriphenyldicarbonsäure als Ligand für die nichtkovalente Bindung von siRNA an die Oberfläche verwendet44. In ähnlicher Weise wurden die Zirkonium-MOFs NU-1000 und PCN-222/MOF-545 über koordinative Wechselwirkungen mit phosphatterminierten Oligonukleotiden funktionalisiert45. Unabhängig vom individuellen Interaktionsmodus sind die Porenabmessungen entscheidende Parameter für den Einbau von Oligonukleotiden in innere Hohlräume, die die Zugänglichkeit zur inneren MOF-Matrix bestimmen46,47. Alternativ wurden große Biomoleküle, einschließlich Nukleinsäuren, durch Biomineralisierung während des Gerüstaufbaus in MOFs eingekapselt48,49. In all diesen Fällen stellen Oligonukleotide Gastmoleküle in unterschiedlichen MOF-Materialien dar. Im Gegensatz dazu wurde die Verwendung von Nukleinsäuren als essentielle Gerüstkomponenten bisher nicht realisiert, obwohl dies als vorteilhaft erachtet wird, um die Beladungskapazität zu erhöhen und die Herstellung zu vereinfachen. Peptidnukleinsäuren (PNAs) sind synthetische Nukleinsäureanaloge, die ein Peptidrückgrat aus N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten enthalten, an die über Carbonylmethylen-Linker Nukleobasen gebunden sind50. Ähnlich wie natürliche Nukleinsäuren binden PNAs mit hoher Affinität und Spezifität an komplementäre DNA-, RNA- oder PNA-Sequenzen. Tatsächlich sind die Affinitäten und Bindungsstärken komplementärer PNA-PNA-, PNA-DNA- oder PNA-RNA-Duplexe höher und weniger von ionischem Stress betroffen als Duplexe aus analogen DNA- oder RNA-Sequenzen51,52. PNAs stellen aufgrund (1) ihrer stabilen und starken Bindungsfähigkeit, (2) guter Fehlpaarungssequenzunterscheidung, (3) synthetischer Zugänglichkeit und Flexibilität und (4) Beständigkeit gegenüber Abbau durch Nukleasen und Proteasen eine leistungsstarke synthetische Nukleinsäuretechnologie dar53,54, 55. Neben bioanalytischen Anwendungen wie Nukleinsäuresondierung, In-situ-Hybridisierung und PCR-Modulation56,57,58,59. PNAs können als Antisense-Oligonukleotide fungieren, um die Genexpression zum Schweigen zu bringen oder das zelluläre mRNA-Spleißen zu modulieren60,61. Ähnlich wie bei anderen Nukleinsäurechemien stellt der zelluläre Transport eine große Herausforderung für Antisense-Anwendungen von PNAs dar. Trotz der neutralen Ladung und des lipophilen Charakters durchdringen PNAs die Zellmembran nicht effizient. Aus diesem Grund wurden PNAs an zelldurchdringende Peptide konjugiert, in Abgabesystemen formuliert oder chemisch modifiziert, um den Zelleintritt zu ermöglichen62,63,64,65. Hier stellen wir neuartige metallorganische Koordinationsnanopartikel auf Basis von PNA-Linkern und Zirkonium(IV) vor (PNA-Zr-Nanopartikel). Nach unserem besten Wissen handelt es sich bei dem vorgestellten Material um das erste Beispiel für Koordinationspolymere, die aus Nukleinsäureanaloga als organische Linkerkomponente aufgebaut sind. Für die Anwendung als Nanoträger weisen PNA-Zr-Nanopartikel eine sehr hohe Beladungskapazität auf, werden leicht von Zellen internalisiert und können funktionelle PNAs zur Spleißkorrektur über sequenzspezifische Interferenz mit endogenen mRNA-Spleißprozessen transportieren.

Das Design und die Auswahl geeigneter organischer Linker ist ein wichtiger Schritt in der MOF-Synthese und hat entscheidenden Einfluss auf die MOF-Eigenschaften und -Charakteristika nach dem Zusammenbau. Die Linker erfordern Lewis-Base-Funktionen mit N- oder O-Donoratomen wie Carbonsäuren oder aromatischen N-Heterocyclen. Die meisten etablierten MOF-Linker besitzen eine starre Struktur mit eingeschränkter Flexibilität aufgrund ungesättigter Bindungen, Zyklen oder Arenen, die die getrennten Lewis-Basenfunktionen verbinden. Um eine Plattform für die Herstellung von PNA-Zr-Koordinationsnanopartikeln zu schaffen, wurden verschiedene PNA-Linker-Architekturen entwickelt, um die Eigenschaften etablierter MOF-Linker nachzuahmen: (1) Aromatische Carbonsäuren wurden an die PNA-Termini gebunden, um Lewis-Base-Funktionen an entfernten Positionen bereitzustellen ; (2) Einzel- und doppelsträngige PNAs wurden verwendet, um die Linkersteifigkeit zu modulieren. Leider sind die meisten gängigen MOF-Synthesen unter Solvothermalbedingungen nicht mit doppelsträngigen PNAs kompatibel, da PNA-Duplexe bei den erforderlichen hohen Temperaturen schmelzen und dissoziieren. Daher musste eine Strategie für die MOF-Synthese bei Raumtemperatur (RT) gewählt werden.

Syntheseprozess von Partikeln, PNA-Modifikationen und Linkerarchitekturen. (A) Synthese von PNA-Zr-Partikeln über einen zweistufigen Prozess. (B) PNA-Endmodifikationen: linke Terephthalsäure (TPA, rot), mittlere para-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA, grün) und rechte Essigsäure (ACI, blau). (C) PNA-Linker-Architekturen. Erstellt mit BioRender.com.

Das Labor von Omar Farha entwickelte eine RT-Synthese von UiO-66, das aus sechskernigen Zirkoniumoxidclustern \(Zr_6 O_4 (OH)_4\) und TPA66 aufgebaut ist. Bei dieser Strategie wird die klassische solvothermale Eintopf-MOF-Synthese in die aufeinanderfolgenden Schritte zerlegt: (1) Vorbildung sekundärer Baueinheiten aus Zirkoniumpropoxid \(Zr(OnPr)_4\) bei hohen Temperaturen in Gegenwart von überschüssiger Essigsäure, gefolgt von ( 2) Zugabe des TPA-Linkers und Inkubation bei RT. Diese Arbeit diente als Grundlage für die Anpassung an Zr-koordinierte Nanopartikel mit temperaturempfindlichen PNA-Linkern. Die Strategie zur Bildung der Partikel ist in Schema 1A dargestellt. Analog zur Arbeit von DeStefano et al.66 werden Koordinationspartikel in einem zweistufigen Prozess gebildet67. Zunächst werden Zr-Knoten durch Inkubation einer Lösung, die \(Zr(OnPr)_4\), DMF und Essigsäure enthält, bei \(130\,^{\circ }\hbox {C}\) für 2 Stunden erzeugt. Anschließend wird die Lösung der Metallknoten auf RT abgekühlt und in einem Molverhältnis von Linker zu Zr von 1:1 zu einer PNA-Linkerlösung gegeben. Bei doppelsträngigen PNA-Linkern wurde ein erster Annealing-Schritt (Erhitzen auf \(90\,^{\circ }\hbox {C}\), Abkühlen auf RT) durchgeführt, um die Duplexbildung vor der Nanopartikelsynthese sicherzustellen. Die Assemblierungsmischung wurde 24 Stunden lang bei RT inkubiert und die gebildeten PNA-Zr-Partikel wurden durch Zentrifugation als weißer Niederschlag isoliert. Wie in Schema 1C dargestellt, wurden mehrere PNA-Linker mit unterschiedlichen Modifikationen entworfen; para-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA) und TPA-Endmodifikationen wurden an den C- (PAMBA) und N- (TPA) Termini von PNA-Sequenzen eingeführt, um als aromatische Carbonsäurefunktionen für koordinative Wechselwirkungen mit Metallknoten zu dienen. Im Gegensatz dazu dienten acetylierte (ACI) N-Termini als Kontrollen ohne Lewis-Base-Funktion. Tabelle 1 fasst die bewerteten PNA-Sequenzen und ihre Fähigkeit zusammen, als Linker für die Partikelbildung mit Zr-Knoten zu dienen.

Es ist wichtig zu beachten, dass PNA-Linker im Allgemeinen durch Größenausschlusschromatographie ohne Säurezusätze im Lösungsmittel gereinigt wurden, da beobachtet wurde, dass HCl-Salze von PNAs die Partikelbildung negativ beeinflussen. Als einfache Modelle doppelsträngiger Linker dienten palindromische PNA-Sequenzen mit Modifikation des N-Terminus (TPA oder ACI), die sich aufgrund der Selbstkomplementarität zu Duplexen zusammenfügen. Die kürzeste palindromische Sequenz, die Partikel mit Zr-Knoten bildete, wies eine Länge von 6 PNA-Monomereinheiten auf, allerdings nur, wenn der N-Terminus mit TPA modifiziert wurde. Im Gegensatz dazu bildeten palindromische 4- und 2-mere unabhängig von TPA- oder ACI-Endmodifikationen keine Partikel. Es wird vermutet, dass die niedrige Schmelztemperatur der kürzeren PNA-Sequenzen für die fehlende Dimerisierung und Bildung von Linkern mit zwei koordinativen Endfunktionalitäten verantwortlich ist68.

Die Beobachtung, dass die Acetylierung im Allgemeinen die Partikelbildung mit Zr-Knoten verhindert, weist auf die Notwendigkeit von TPA als Endmodifikation der Lewis-Base hin. Konsequenterweise konnte auch die Kombination von zwei komplementären, nicht-palindromischen 6-mer-PNAs mit TPA an den N-Termini Partikel bilden, allerdings war ein genaues Molverhältnis beider PNAs von 1:1 wesentlich. PNA-Sequenzen, die mit zwei Metallkoordinationsstellen an den N- (TPA) und C- (PAMBA) Termini ausgestattet waren, waren für die Partikelbildung geeignet, unabhängig davon, ob sie als Duplex mit einem zusätzlichen Komplementärstrang (ohne PAMBA und TPA) oder als Einzelstrang verwendet wurden. alleiniger gestrandeter Linker. Die Kombination einer PNA-Sequenz mit einem TPA am N-Terminus und der komplementären PNA ohne Modifikation, die zu einer doppelsträngigen PNA mit nur einer aromatischen Carbonsäure-Endfunktion führt, führte zu einer geringfügigen Bildung von Feststoffen. Die Beobachtungen zeigen, dass sowohl einzel- als auch doppelsträngige PNAs in der Lage sind, Koordinationspartikel mit Zr-Knoten zu bilden, jedoch sind zwei Carbonsäure-Endfunktionen erforderlich, um erhebliche Mengen zu ergeben.

Die erhaltenen PNA-Zr-Partikel wurden durch eine Reihe physikalisch-chemischer Charakterisierungstechniken charakterisiert. Partikelgröße, Morphologie und Oberflächenladung wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) bestimmt. Repräsentative SEM-Bilder (Abb. 1) zeigen kleine (zwischen 150 und 250 nm Durchmesser), meist kugelförmige Partikel, die mit verschiedenen PNA-Linkern gebildet wurden. DLS-Messungen (Abb. S1 im Electronic Supplementary Material, ESM) zeigten größere Partikel mit z-Mittelwerten zwischen 500 und 1000 nm. Die Abweichung kann durch eine hohe Empfindlichkeit des DLS gegenüber Aggregaten und größeren Partikeln sowie durch die Tatsache erklärt werden, dass DLS hydrodynamische Partikelgrößen in Lösung erkennt, während REM-Messungen mit getrockneten Proben durchgeführt werden69. Elektrophoretische Lichtstreuungsmessungen ermittelten negative Zetapotentiale zwischen \(-5\) und \(-10\) mV.

Repräsentative REM-Bilder von PNA-Zr-Nanopartikeln. Die Sequenzen der einzelnen PNA-Linker sind in der oberen linken Ecke der Bilder angegeben. Als Referenz wurde TPA verwendet, das zur Bildung von UiO-66 führte (Maßstabsbalken = 3 \(\upmu\)m).

Die thermische Stabilität von PNA-Zr-Partikeln wurde durch Überwachung der optischen Dichte (400 nm) von Nanopartikelsuspensionen untersucht, die einem Temperaturgradienten ausgesetzt waren. Im Allgemeinen werden Trübungs- oder Lichtstreuungsmessungen bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum durchgeführt, die nicht mit Absorptionsmaxima einzelner Komponenten überlappt; PNAs haben, ähnlich wie andere Nukleinsäureanaloga, ein Absorptionsmaximum im UV-Spektrum bei 260 nm70,71. Wie in Abb. 2C zu sehen ist, sind PNA-Zr-Partikel unabhängig von der PNA-Linker-Architektur bei RT stabil. Bei höheren Temperaturen zerfallen Partikel, die aus doppelsträngigen Linkern mit TPA-Modifikation an beiden Strängen aufgebaut sind, bei erhöhten Temperaturen, was als Abfall der optischen Dichte erkennbar ist. Eine vernünftige Erklärung ist, dass die PNA-Duplexe bei den erhöhten Temperaturen schmelzen, was zur Zerlegung der Linker mit TPA-Funktion an beiden Enden führt. Im Gegensatz dazu zeigten Partikel, die Linker mit PAMBA und TPA in einem Einzelstrang enthielten, keine ähnliche Temperaturempfindlichkeit. Diese Ergebnisse legen zwei Schlüsselmerkmale der PNA-Zr-Nanopartikel nahe: (1) zwei aromatische Carbonsäurefunktionen, die sich an beiden Enden der PNA-Linker befinden, sind wesentlich; und (2) doppelsträngige Linker mit auf beiden Strängen getrennten aromatischen Carbonsäurefunktionen reagieren empfindlich auf Linkerzerlegung durch Duplexschmelzen. Die Stabilität von PNA-Zr-Partikeln in biologischen Puffern, isohydrischem HEPES (20 mM, pH 7,4) sowie isohydrischem und isotonischem HBG (20 mM HEPES, pH 7,4, 5 % Glucose), wurde mit dem gleichen Ansatz untersucht (Abb. 2A, B). PNA-Zr-Partikel wurden HBG oder HEPES zugesetzt und die optische Dichte wurde bei 400 nm über die Zeit überwacht. Ähnlich wie bei den Ergebnissen der thermischen Stabilitätsstudie zeigten Partikel, die Linker mit zwei aromatischen Carbonsäurefunktionen in einem einzelnen PNA-Strang enthielten, eine höhere Stabilität, während Partikel, die aus doppelsträngigen Linkern mit TPA-Modifikationen in separaten Strängen bestanden, dissoziierten.

Röntgenbeugung (XRD) wurde verwendet, um das Vorhandensein von Kristallinität in repräsentativen PNA-Zr-Nanopartikeln aufzuklären, die aus doppelsträngigen (palindromischen GCATGA-TPA) oder einzelsträngigen (nicht-palindromischen PAMBA-CGTGAC-TPA und PAMBA-CCTCTTACCTCAGTTACA-) aufgebauten Nanopartikeln aufgeklärt wurden. TPA)-Linker (Abb. S2 im ESM). Im Gegensatz zu den charakteristischen Reflexen, die mit UiO-66 erhalten wurden, wurde durch XRD kein Hinweis auf Kristallinität von PNA-Zr-Nanopartikeln gefunden; Daher werden eher amorphe Strukturen von PNA-Zr-Koordinationspartikeln vorgeschlagen. Eine weitere Charakterisierung durch Stickstoffsorption ergab eine Oberfläche von 300 m\(^{2}\)/g für PNA-Zr-Nanopartikel aus GCATGA-TPA und 36 m\(^{2}\)/g für Nanopartikel aus PAMBA- CGTGAC-TPA (Abb. S3, Tabelle S3 im ESM)72. Die Absorptionsisotherme von PAMBA-CGTGAC-TPA zeigte Ähnlichkeit mit einer Typ-II-Absorptionsisotherme, was auf eine nichtporöse oder makroporöse Struktur hinweist, wohingegen GCATGA-TPA keinem charakteristischen Typ zugeordnet werden konnte73,74.

Als nächstes wurde der Zr-Gehalt der PNA-Zr-Partikel durch induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektrometrie (ICP-AES, Abb. 2D) bestimmt. Für PAMBA-CGTGAC-TPA-Partikel wurde ein Zr-Gehalt von 52 mg/g und für PAMBA-CGTGAC-TPA-Partikel ein Gehalt von 31 mg/g ermittelt Zr für GCATGA-TPA-Partikel, was einen sehr hohen PNA-Gehalt von 94,8 % bzw. 96,9 % widerspiegelt. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen und den Molekulargewichten der PNA-Linker wurde die Stöchiometrie der Komponenten in der Partikelanordnung berechnet. Molverhältnisse Für beide repräsentativen Typen von PNA-Zr-Nanopartikeln wurde ein Verhältnis von Zr zu Linker von etwa 1,2:1 ermittelt, was nahe an dem für UiO-6618 berichteten Verhältnis von 1:1 liegt.

Stabilität von PNA-Zr-Partikeln und ICP-AES. Stabilität von PNA-Zr-Partikeln bestimmt durch Messung der optischen Dichte (400 nm) nach Inkubation in (A) HBG, (B) HEPES oder (C) bei erhöhten Temperaturen. PNA-Linker-Architekturen werden durch Farben angezeigt (siehe Legende unten). (D) Zr-Gehalt von PNA-Zr-Partikeln, bestimmt durch ICP-AES und resultierende Molverhältnisse, berechnet unter Berücksichtigung des Molekulargewichts der Linker.

Der Fluoreszenzfarbstoff Calcein, der Lewis-Base-Funktionen enthält und mit Metallionen Chelate bilden kann, wurde zur Markierung von PNA-Zr-Partikeln durch koordinative Wechselwirkung verwendet42,75. Hierzu wurden PNA-Zr-Partikel mit einer wässrigen Calceinlösung (0,25 mM) bei RT inkubiert. Am Ende des Markierungsvorgangs war ein deutlicher Farbumschlag von weißen zu orangefarbenen Partikeln zu beobachten (Abb. 3A). Der direkte Vergleich markierter und unmarkierter PNA-Zr-Partikel im etablierten Stabilitätstest bestätigte, dass die Calceinbeladung keinen Einfluss auf die Stabilitätseigenschaften von HBG hatte (Abb. 3B). Mit Calcein beladene PNA-Zr-Partikel auf Basis von GCATGA-TPA wurden innerhalb von 1 Stunde in HBG abgebaut, während PAMBA-CGTGAC-TPA-Partikel keine signifikante Partikelzerlegung zeigten. Darüber hinaus wurde das nanoskopische Erscheinungsbild markierter und unmarkierter PNA-Zr-Partikel mittels REM-Bildgebung verglichen. Wie in Abb. 3D,E zu sehen ist, hatte die Calceinbeladung keinen wesentlichen Einfluss auf die Größe und Form der Partikel. ELS-Messungen (Abb. 3C) zeigten einen leichten Anstieg des Zetapotentials bei der Calceinbeladung, die Gesamtladung der Nanopartikel blieb jedoch negativ. Die Ergebnisse, die unbeeinflusste Partikeleigenschaften zeigten, waren wesentliche Voraussetzungen für die folgende Bestimmung der Zellaufnahme mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bildgebung von Calcein-beladenen PNA-Zr-Nanopartikeln (Abb. 3F).

HeLa pLuc/705-Zellen wurden 4 Stunden lang mit markierten Partikeln basierend auf doppelsträngigen palindromischen GCATGA-TPA- oder einzelsträngigen PAMBA-CGTGAC-TPA-Linkern inkubiert, gefolgt von einem Mediumwechsel und einer weiteren 4-stündigen Inkubation. CLSM-Bildgebung zeigte, dass beide Arten von PNA-Zr-Nanopartikeln von den Zellen internalisiert wurden, wohingegen freies Calcein in der Konzentration, die der maximalen Partikelbeladung entspricht, intrazellulär nicht nachgewiesen werden konnte. Dies weist darauf hin, dass PNA-Zr-Nanopartikel für den intrazellulären Transport undurchlässiger Verbindungen geeignet sind und dass die Partikel im Zellkulturmedium nicht dissoziieren.

Mit Calcein beladene Partikel (A) Repräsentative Bilder von PNA-Zr-Partikeln vor und nach der Calcein-Beladung. (B) Stabilität von Calcein-beladenen und unmarkierten PNA-Zr-Partikeln in HBG, bestimmt durch Messung der optischen Dichte (400 nm). (C) Zetapotential von mit Calcein beladenen Partikeln, gemessen mit ELS. (D) Repräsentative SEM-Bilder von Calcein-beladenen und unbeschrifteten PNA-Zr-Nanopartikeln. Die einzelnen Linker, die für den Partikelaufbau verwendet werden, sind in der oberen linken Ecke jedes Bildes angegeben (Maßstabsbalken = 2 \(\upmu\)m). (E) Bewertung der Partikelgrößen, die durch SEM-Bildgebung erhalten wurden (Durchmesser, nm). Für die Bestimmung wurden n = 30 Zufallspartikel ausgewertet. (F) CLSM-Bilder von HeLa pLuc/705-Zellen, die mit Calcein (grüne Fluoreszenz) beladenen PNA-Zr-Partikeln behandelt wurden. Die Zellen wurden 4 Stunden lang mit Calcein-beladenen Partikeln (0,04 \(\upmu\)g/\(\upmu\)L) oder freiem Calcein in der Konzentration inkubiert, die dem maximalen Calcein-Gehalt der Partikel (0,0005 \(\upmu\) entspricht. g/\(\upmu\)L). Anschließend wurden die Zellen vor der Bildgebung weitere 4 Stunden mit frischem Medium inkubiert. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) angefärbt und Aktin wurde durch Anfärben mit Phalloidin-Rhodamin (rot) sichtbar gemacht.

Da PNAs als Antisense-Oligonukleotide verwendet werden können, die den zellulären mRNA-Spleißprozess modulieren, wurde die Fähigkeit von PNA-Zr-Koordinationsnanopartikeln bewertet, funktionelle Spleiß-schaltende PNAs in Zellen zu transportieren. Kang et al. generierte HeLa-Zellen mit stabiler Expression eines Luciferase-Reporters (pLuc/705) zum Nachweis von Korrekturen des aberranten \(\beta\)-Globin-Spleißens, das durch eine Intronmutation (IVS2-705) verursacht wird76,77. Hier haben wir PNA-Zr-Partikel erzeugt, die die PNA-Sequenz an der Stelle von IVS2-705 enthalten, die bei Abgabe in den Zellkern eine Spleißkorrektur induzieren kann. Mit diesem Testsystem können eine erfolgreiche zelluläre Abgabe und Spleißschaltaktivität über Biolumineszenz aufgrund der Induktion der funktionellen Luciferase-Expression nachgewiesen werden77,78. Für die Partikelbildung wurde ein einzelsträngiger PNA-Linker mit der Sequenz PAMBA-CCTCTTACCTCAGTTACA-TPA (705 SSO) über den etablierten zweistufigen Bildungsprozess verwendet.

FT-IR-Spektroskopie bestätigte das Vorhandensein des relativ langen 705 SSO-PNA in den abgeleiteten PNA-Zr-Partikeln (Abb. S4 im ESM). Durch Quantifizierung der Menge an eingekapselter PNA nach der Zersetzung der PNA-Zr-Partikel wurde eine Einkapselungseffizienz von 85,2 %, bezogen auf die zur Synthese eingesetzte PNA-Menge, ermittelt. HeLa pLuc/705-Zellen wurden mit den PNA-Zr-Nanopartikeln behandelt und das Auftreten von Splice-Switching wurde durch Bestimmung der Luciferase-Aktivität mittels Biolumineszenzmessungen nach 48 Stunden beurteilt. In vorläufigen Experimenten konnten die bloßen PNA-Zr-Partikel keine nachweisbare Spleißkorrektur vermitteln. Da die zelluläre Aufnahme von PNA-Zr-Partikeln zuvor nachgewiesen wurde, wurde vermutet, dass hierfür ein unzureichender endosomaler Austritt verantwortlich ist, der im Allgemeinen eine kritische Hürde für die Abgabe von Biomakromolekülen darstellt. Um den endosomalen Austritt zu verbessern und den Transport zum intrazellulären Zielvisier zu ermöglichen, wurden PNA-Zr-Partikel mit einem kationischen künstlichen Peptid beschichtet (Abb. 4A, B). Das Lipopeptid (LP) LenA (Kε(N3)-Y3-Stp2-Kε[G-Kα,ε(Linolensäure)2]-Stp2-Y3) hat sich zuvor als geeignetes Mittel für die Abgabe von Spleiß-schaltendem Phosphordiamidat erwiesen Morpholino-Oligomere (PMOs) in HeLa pLuc/705-Zellen nach kovalenter Konjugation78.

Da PNA-Zr-Partikel ein negatives Zetapotential sowie koordinativ ungesättigte Metallstellen an der Außenoberfläche besitzen, wird die Beschichtung mit dem Oligo(ethanamino)amid LP LenA als praktikable Strategie für die postsynthetische Nanopartikelmodifikation vorgeschlagen. Die SEM-Bildgebung bestimmte die Morphologie der Partikel, die aus den langen 705 SSO-PNA-Linkern zusammengesetzt wurden (Abb. S5 im ESM). Die Ergebnisse zeigten, dass 705 SSO-Zr-Nanopartikel größtenteils kugelförmig waren und kleine Größen zwischen 150 und 250 nm Durchmesser aufwiesen. Nach der Beschichtung mit LP LenA blieb die Kugelform erhalten, obwohl eine leichte Größenzunahme zu beobachten schien. Die erfolgreiche Modifizierung der 705 SSO-Zr-Nanopartikeloberfläche mit LP LenA wurde weiter durch Zetapotentialmessungen bestätigt, die eine deutliche Verschiebung vom negativen (\(-12\) mV) zum positiven Zetapotential (+28 mV) nach der Beschichtung ermittelten ( Abb. S6 im ESM). In der vorherigen Arbeit wurde festgestellt, dass LP LenA eine günstige endosomale Freisetzung von PMO-Konjugaten vermittelt, vermutlich aufgrund endosomaler Membranwechselwirkungen der enthaltenen ungesättigten Linolensäurereste. Um zu bestätigen, dass die vorteilhaften Auswirkungen von LP LenA auf die zelluläre Abgabe auch in Kombination mit PNA-Zr-Partikeln genutzt werden können, wurden HeLa mRuby3/gal8-Reporterzellen verwendet, die Auswirkungen auf die Integrität der endosomalen Membran sichtbar machen können. Die Reporterzellen exprimieren ein Fusionsprotein aus Galectin-8 und mRuby3. Galectin-8 ist ein zytosolisches Protein, das sich aufgrund der Bindung an Glykosylierungseinheiten auf der Innenoberfläche endosomaler Membranen an beschädigten Endosomen ansammelt79,80. HeLa mRuby3/gal8-Zellen wurden 8 Stunden lang mit unbeschichteten 705 SSO-Zr-Nanopartikeln, LP LenA-beschichteten 705 SSO-Zr-Partikeln oder HBG-Puffer behandelt. CLSM-Bildgebung nach zusätzlicher 4-stündiger Inkubation mit frischem Medium zeigte, dass HBG-Puffer und unbeschichtete Partikel nicht zu einer Umverteilung von zytosolischem Galectin-8 führten und keine Störung der endosomalen Membranintegrität nachweisbar war (Abb. 4C). Im Gegensatz dazu zeigten HeLa-mRuby3/gal8-Zellen, die mit LP-LenA-beschichteten Partikeln behandelt wurden, eine punktuelle Verteilung von mRuby3/gal8-Signalen mit höherer Fluoreszenzintensität aufgrund endosomaler Membranschäden. Insgesamt stützen die Ergebnisse die Hypothese, dass LP-LenA das endosomale Entweichen von PNA erleichtern kann. Zr-Partikel.

Um die Spleißschaltaktivität zu bestimmen, wurden HeLa pluc/705-Zellen 48 Stunden lang mit 705 SSO-Zr-Partikeln oder dem freien PNA-Linker mit und ohne LP LenA inkubiert, gefolgt von einem Luciferase-Aktivitätstest. Um jegliche Hintergrund-Luciferase-Aktivität auszuschließen, wurden die Lumineszenzniveaus auf HBG-behandelte Kontrollzellen normalisiert und als „fache Zunahme der Lumineszenz“ bestimmt77,78. Wie in Abb. 4d dargestellt, gibt es eine Reihe unterschiedlicher Verhältnisse zwischen PNA und LP LenA (1/0,5, 1/0,75, 1/1, 1/1,25, 1/1,5, 1/2, 1/2,5, 1/3). wurden benutzt.

Zellen, die mit 5 \(\upmu\)M freiem 705 SSO PNA inkubiert wurden, zeigten bei keinem Mischungsverhältnis von PNA zu LP LenA eine erhöhte Luciferase-Aktivität. Im Gegensatz dazu ergab die kovalente Konjugation eines DBCO-modifizierten 705 SSO-PNA-Derivats an LP LenA mittels kupferfreier Klick-Chemie eine Formulierung mit ausgeprägter Spleißschaltaktivität (Abb. S7 im ESM). Wichtig ist, dass mit LP LenA beschichtete 705 SSO-Zr-Partikel die Lumineszenzwerte bei Verhältnissen zwischen 1:0,5 und 1:3 deutlich erhöhten. Der höchste Anstieg der Lumineszenz (125-fach) wurde bei einem PNA/LP-LenA-Verhältnis von 1/1,25 erreicht, was als optimale Beschichtungsbedingung ermittelt wurde. Dosistitrationen mit freien PNA- und PNA-Zr-Nanopartikeln beim optimalen PNA/LP-LenA-Verhältnis von 1/1,25 wurden in einem PNA-Konzentrationsbereich zwischen 0,156 \(\upmu\)M und 5 \(\upmu\)M durchgeführt ( Abb. 4e). In Übereinstimmung mit den vorherigen Ergebnissen induzierte freies 705 SSO/LP LenA bei keiner Konzentration eine erhöhte Luciferase-Aktivität, wohingegen PNA-Zr-Partikel die Lumineszenz bei PNA-Konzentrationen zwischen 0,625 und 5 \(\upmu\)M um das 20- bis 120-fache erhöhten . Im direkten Vergleich induzierten die mit LP LenA beschichteten 705 SSO-Zr-Partikel ein konkurrierendes Maß an Luciferase-Aktivität als die kovalente LP LenA PNA-Konjugatformulierung [Abb. S7 im ESM]. Im Gegensatz dazu war Lipofectamine 3000, das als kommerziell erhältliches Transfektionsmittel enthalten war, nicht in der Lage, die Luciferase-Aktivität zu erhöhen. Diese Beobachtung ist nicht überraschend, da PNA ungeladene Nukleinsäureanaloge darstellen und für die zelluläre Abgabe kationischer Lipide eine Modifikation mit negativ geladenen oder lipophilen Einheiten erforderlich wäre81,82,83. Um den Vorteil der PNA-Zr-Nanopartikelbildung für die zelluläre Abgabe zusätzlich zu bestätigen, wurde ein weiteres Kontrollexperiment durchgeführt (Abb. S8 im ESM). Phosphatpuffer (PBS) wurde verwendet, um mit PNA-Linkern zu konkurrieren und Zr-Linker-Wechselwirkungen zu destabilisieren. 705 SSO-Zr-Nanopartikel mit LP LenA im optimalen Verhältnis von 1/1,25 wurden durch Inkubation mit PBS zerlegt. Die Behandlung von HeLa pLuc/705-Zellen mit der erhaltenen Lösung zeigte vernachlässigbare Auswirkungen auf die Lumineszenzniveaus. Die Ergebnisse zeigen, dass die anfänglich sehr effizienten PNA-Zr-Nanopartikel bei der Partikelzerstörung ihr Transportpotential verloren. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass bioaktive PNA entweder kovalent an Trägermoleküle konjugiert oder alternativ zur zellulären Abgabe zu Nanopartikeln zusammengesetzt werden kann.

Um die Kinetik des Spleißwechsels und den Beginn der Luciferase-Expression zu beurteilen, wurde der Einfluss der Inkubationszeit mit 705 SSO-Zr/LP-LenA-Partikeln im optimalen Beschichtungsverhältnis (1/1,25) untersucht. HeLa pLuc/705-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen von PNA-Zr-Nanopartikeln 12, 24, 36 und 48 Stunden lang inkubiert und die Luciferase-Aktivität bestimmt (Abb. S9 im ESM). Der Grund für die offensichtliche Verzögerung der Luciferase-Induktion ist nicht offensichtlich, könnte aber mit der langsamen Freisetzung der PNA aus Endosomen, der langsamen Freisetzung der PNA aus den Nanopartikeln und dem wesentlichen intrazellulären Transport in den Zellkern zusammenhängen.

Um zu bestätigen, dass die erhöhte Luciferase-Aktivität tatsächlich mit sequenzspezifischen Effekten der splice-switching Antisense-PNA zusammenhängt, wurden Partikel aus PNA-Linkern mit alternativen Sequenzen (PAMBA-GAGTATGAGA-TPA und PAMBA-GCAGCT-TPA) als Kontrollen verwendet (Abb. S10 im ESM). HeLa pLuc/705-Zellen wurden 48 Stunden lang mit den Kontroll-PNA-Zr-Partikeln mit LP-LenA-Beschichtung im optimalen Verhältnis 1/1,25 behandelt. Der anschließende Luciferase-Aktivitätstest ergab, dass Partikel ohne 705 SSO-PNA die Luciferase-Aktivität nicht erhöhten, was bestätigt, dass die beobachtete Wirkung von 705 SSO-Partikeln sequenzabhängig ist.

Die Tatsache, dass Partikel durch übermäßige Mengen an Phosphationen zerlegt werden können, warf die Frage nach der Stabilität bei verschiedenen physiologischen Phosphatkonzentrationen (z. B. 1,12 mM bis 1,45 mM im Serum)84 auf. Um diesen Aspekt zu berücksichtigen, wurde die Partikelstabilität in verschiedenen PBS-Verdünnungen gemessen, die zu unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen führten, sowie in 20 % gefiltertem (0,2 \(\upmu\)m) fötalem Rinderserum (FBS) (Abb. S11 im ESM). Hierbei wurde eine phosphatkonzentrationsabhängige Abnahme der Partikelstabilität beobachtet, die zu einer verringerten biologischen Stabilität, aber auch zu einer günstigen intrazellulären Freisetzung von PNA führen könnte, da die Phosphatkonzentration im Inneren der Zellen höher ist. Ebenso zeigten die Partikel eine Empfindlichkeit gegenüber der Anwesenheit von FBS und dissoziierten im Laufe einer Stunde. Bemerkenswert ist, dass die Beschichtung mit LP LenA die Serumstabilität der Partikel deutlich erhöhte, was neben der Erleichterung des endosomalen Entweichens einen weiteren Vorteil darstellte.

Der beabsichtigte Spleißschalter des mutierten \(\beta\)-Globin-Introns im HeLa pLuc/705-Modell wurde zusätzlich durch RT-PCR bestätigt (Abb. 4f, Abb. S12 im ESM). Die Gesamt-RNA wurde 48 Stunden nach der Behandlung mit 705 SSO-Zr/LP LenA im optimalen Verhältnis 1/1,25 aus HeLa pLuc/705-Zellen extrahiert. Anschließend wurde die Sequenz rund um \(\beta\)-Globin IVS2 durch RT-PCR amplifiziert und mittels Agarose-Elektrophorese analysiert. Die einzelne Bande (268 bp), die aus HBG-behandelten Kontrollzellen erhalten wurde, stellt das unveränderte aberrante Spleißprodukt dar. Bei mit 705 SSO-Zr-Nanopartikeln behandelten Zellen wurde ein dosisabhängiges Auftreten einer zusätzlichen Bande (142 bp) beobachtet, die dem spleißkorrigierten Produkt entsprach. Im Gegensatz zu den Luciferase-Messungen ist dieser Assay (semi)quantitativ und zeigt somit etwa 22 %, 9 % und 5 % Spleißkorrektur bei 5 \(\upmu\)M, 2,5 \(\upmu\)M und 1,25 \( \upmu\)M PNA-Konzentration (bestimmt durch Bilddatenanalyse der Bandenintensitäten).

Die potenzielle Zytotoxizität der PNA-Zr-Partikel wurde durch den CellTiter-Glo\(^\circledR\)-Assay mit HeLa-Wildtyp-Zellen untersucht (Abb. S7(b), S13 im ESM). Analog zu den Splice-Switching-Experimenten wurden Zellen 48 Stunden lang mit freier PNA oder PNA-Zr-Partikeln in unterschiedlichen Konzentrationen und LP-LenA-Verhältnissen inkubiert. Ohne LP LenA vermittelten weder freie PNA noch PNA-Zr-Partikel Auswirkungen auf die Stoffwechselaktivität bei 5 µM, wohingegen in Kombination mit dem Lipopeptid eine dosis- und verhältnisabhängige Verringerung der Stoffwechselaktivität oberhalb von 1,25 µM erkennbar war. (\upmu\)M und wird bei 5 \(\upmu\)M ausgesprochen (Abb. S10(b), S13 im ESM). Dementsprechend wurde in Zellen, die mit 5 μM PNA-Zr-LP-LenA-Partikeln behandelt wurden, eine geringere zelluläre Luciferase-Aktivität beobachtet, verglichen mit 2,5 μM (Abb. 4e), was mit einer niedrigeren Zelle übereinstimmt Lebensfähigkeit. Es ist nicht überraschend, dass LP LenA in Analogie zu anderen wirksamen Wirkstoffen und kationischen Lipiden die Lebensfähigkeit der Zellen dosisabhängig beeinflusst, z. B. durch Störung der Integrität der Lipidmembran85,86. Dennoch gilt die Kombination von PNA-Zr-Partikeln mit LP-LenA-Beschichtung als eine praktikable Strategie zur Erhöhung der Partikelstabilität, zur Erleichterung der endosomalen Freisetzung und zur Verbesserung der intrazellulären PNA-Abgabe. Tatsächlich kann die Optimierung der Partikelparameter, Beschichtungsverhältnisse und der Zusammensetzung des Beschichtungsmittels zu einem günstigen Gleichgewicht zwischen Abgabeeffizienz und Verträglichkeit führen.

Lieferung funktioneller PNA durch PNA-Zr-Koordinationsnanopartikel (A) Struktur von LP LenA bestehend aus: N-terminalem Azidolysin, Tyrosin (Y), Lysin (K), Succinyltetraethylenpentamin (Stp), Glycin (G) und Linolensäure. (B) Schematische Darstellung von LP-LenA-beschichteten PNA-Zr-Nanopartikeln und dem intrazellulären Abgabeprozess. Erstellt mit BioRender.com. (C) CLSM-Bilder von HeLa mRuby3/gal8-Zellen, behandelt mit 705 SSO-Zr-Partikeln (links), LP LenA-beschichteten 705 SSO-Zr-Partikeln (Verhältnis 1/1,25, Mitte) und HBG-Kontrolle (rechts). mRuby3/gal8-Zellen wurden 8 Stunden lang mit Partikeln (2,5 \(\upmu\)M PNA-Gehalt) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen vor der Bildgebung weitere 4 Stunden mit frischem Medium inkubiert. (D) Spleißschaltaktivität von 705 SSO-Zr-Nanopartikeln (5 \(\upmu\)M PNA) bei unterschiedlichen PNA/LP-LenA-Beschichtungsverhältnissen in HeLA pLuc/705-Zellen. (E) Spleißschaltaktivität von 705 SSO-Zr-Nanopartikeln (1/1,25 PNA/LP LenA-Verhältnis) bei unterschiedlichen PNA-Konzentrationen in HeLA pLuc/705-Zellen. (F) RT-PCR von \(\beta\)-Globin IVS2 aus HeLa pLuc/705-Zellen, behandelt mit PNA-Zr/LP LenA im Verhältnis 1/1,25. Gesamt-RNA wurde 48 Stunden nach den Behandlungen isoliert und \(\beta\)-Globin IVS2 wurde amplifiziert. Die Bande bei 268 bp stellt das abweichende Spleißprodukt dar; Die Bande bei 142 bp entspricht dem Produkt nach dem Splice-Switch. Das Bild wurde zur klaren Darstellung zugeschnitten, das Originalgel ist in Abb. S12 im ESM zu sehen.

Diese Arbeit berichtet über neuartige metallorganische Nanopartikel, die durch koordinationsgesteuerte Selbstorganisation von Peptid-Nukleinsäure-Linkern und Zr(IV)-Knoten erzeugt werden. Eine systematische Variation von PNA-Linker-Architekturen identifizierte wesentliche Design- und Syntheseparameter: (1) Einzel- und doppelsträngige PNA-Linker erfordern zwei aromatische Carbonsäurefunktionen (PAMBA, TPA) für die koordinative Wechselwirkung mit Zr(IV)-Knoten; (2) doppelsträngige PNA-Linker mit getrennten aromatischen Carbonsäuren auf beiden Strängen erfordern mindestens 6-mer-Sequenzen; (3) Die Nanopartikelsynthese erfordert ein zweistufiges Verfahren mit der Vorbildung von \(Zr_{6}O_{4}(OH)_{4}\)-Knoten vor dem Zusammenbau mit PNA-Linkern bei RT; (4) Nanopartikel, die aus doppelsträngigen PNA-Linkern mit getrennten aromatischen Carbonsäuren auf beiden Strängen aufgebaut sind, reagieren empfindlich auf thermischen Abbau, vermutlich aufgrund des Schmelzens der PNA-Linker; und (5) Nanopartikel, die aus PNA-Linkern mit beiden aromatischen Carbonsäuren auf einem Einzelstrang aufgebaut sind, weisen die höchste Stabilität auf. Die amorphen PNA-Zr-Nanopartikel verfügen über eine außergewöhnliche PNA-Beladungskapazität von > 94 % w/w, werden leicht von Zellen aufgenommen und können nach der Beschichtung mit einem kationischen Lipopeptid funktionelle Antisense-PNAs liefern, um die Partikelstabilität zu erhöhen und die endosomale Freisetzung zu erleichtern. PNA-Zr-Nanopartikel reagieren empfindlich auf konkurrierende Wechselwirkungen und werden mit der Zeit abgebaut, wenn sie Phosphationen oder Serum ausgesetzt werden. Schließlich wurde eine erfolgreiche Modulation des mRNA-Spleißens durch die Bereitstellung einer spleißschaltenden Antisense-PNA über mit Lipopeptid beschichtete PNA-Zr-Nanopartikel erreicht.

Basierend auf den identifizierten Designkriterien wurde eine hochflexible Plattform etabliert, die anpassbare PNA-Linker-Chemie mit koordinativ gesteuerter Selbstorganisation kombiniert, um Nanopartikel mit geprägter biologischer Aktivität zu erzeugen. Es wird vermutet, dass die vorgestellte PNA-Zr-Nanopartikelplattform eine hohe Flexibilität für die Erzeugung sequenzindividueller, bioaktiver Nanopartikel mit potenziellem Potenzial für die Arzneimittelformulierung in RNA-Therapeutika bietet.

Alle Reagenzien wurden von kommerziellen Chemikalienlieferanten gekauft. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reagenzien wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet. Die für die Experimente verwendeten Reagenzien sind in Tabelle S1 zusammengefasst. Die für die Experimente verwendeten Puffer sind mit ihrer Zusammensetzung in Tabelle S2 zusammengefasst.

Eine Menge von 1 g 2-Chlortritylchloridharz (ca. 1,6 mmol Chlorid) wurde 30 Minuten lang in 10 ml trockenem Dichlormethan (DCM) in einem Spritzenreaktor (Multisyntech, Witten, Deutschland) vorgequollen. Dann wurde DCM durch Vakuumfiltration entfernt. Das Harz wurde 60 Minuten lang mit einer Lösung gerührt, die 3 ml N,N-Dimethylformamid (DMF), 4 ml trockenes DCM, 0,6 mmol 4-(Fmoc-Aminomethyl)benzoesäure (Fmoc-PAMBA-OH) und 1,8 enthielt mmol N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA). Anschließend wurde die Lösung durch Vakuumfiltration verworfen und eine Verkappungslösung mit 4 ml DCM, 3 ml Methanol und 500 μl DIPEA hinzugefügt. Nach 30-minütigem Rühren wurde die Lösung entfernt und das Harz dreimal mit DMF und DCM gewaschen. Das Harz wurde im Hochvakuum getrocknet und drei Proben zur Beladungsbestimmung entnommen. Die Proben wurden mit 1 ml 20 % Piperidin in DMF 1 Stunde lang bei RT gerührt. 50 μl des Überstands jeder Probe wurden mit 1,95 ml DMF verdünnt und die Absorption bei 301 nm wurde mit einem Cary 3500 UV-Vis-Spektrophotometer (Agilent Technologies, USA) gemessen. Als Blindlösung wurden 50 μl 20 %iges Piperidin in DMF, verdünnt mit 1,95 ml DMF, verwendet. Die Harzbeladung wurde anhand der folgenden Formel ermittelt:

PNA-Synthesen wurden mit einem halbautomatischen Peptidsynthesizer Biotage Initiator+ SP Wave (Biotage, Uppsala, Schweden) im 30-\(\upmu\)mol-Maßstab in 10-ml-Reaktoren durchgeführt. Für die Synthese von PNA-Sequenzen mit C-terminalem PAMBA wurde PAMBA-beladenes 2-Chlortritylchlorid-Harz verwendet, ansonsten wurde ein H-Rink-Amid-Chemmatrix®-Harz verwendet. Zunächst wurde die erforderliche Harzmenge 30 Minuten lang in 5 ml DCM vorgequollen. Anschließend wurde das Harz durch viermalige Inkubation mit 3 ml 20 % Piperidin in N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für 10 Minuten bei RT entschützt, gefolgt von fünf Waschschritten mit 4 ml NMP. Die Kopplung der PNA-Monomere erfolgte durch Inkubation von 4 Äq. PNA-Monomer, 4 Äq. Oxyma und 4 Äq. von DIC mit dem Harz für 6 min bei \(75\,^{\circ }\hbox {C}\) (Mikrowellenbestrahlung). Auf jeden Kopplungsschritt folgte eine dreifache Harzwäsche mit NMP und eine Acetylierungsreaktion, um verbleibende freie Amine zu blockieren. Die Acetylierung erfolgte durch 3-minütige Inkubation bei RT mit 2,25 ml einer Mischung, die NMP/2,6-Lutidin/Essigsäureanhydrid im Verhältnis 89/6/5 (v/v/v) enthielt. Die Fmoc-Entschützungsschritte wurden durch viermalige Inkubation mit 2,4 ml 20 %igem Piperidin in NMP bei RT für 10 Minuten und anschließendes fünfmaliges Waschen des Harzes mit 2,5 ml NMP durchgeführt. Nach jedem Kopplungs- und Entschützungsschritt wurde ein Kaiser-Test durchgeführt, um das Vorhandensein freier Amine zu bestimmen. Dazu wurde eine kleine Harzprobe in ein 1,5-mL-Reaktionsröhrchen überführt und jeweils ein Tropfen 80 % Phenol in Ethanol (w/v), 5 % Ninhydrin in Ethanol (w/v) und 20 \(\upmu\)M hinzugefügt Kaliumcyanid in Pyridin hinzugefügt. Die Mischung wurde 4 Minuten lang unter Schütteln bei \(99\,^{\circ }\hbox {C}\) inkubiert. Der Kaiser-Test zeigt das Vorhandensein freier Amine durch die Veränderung der gelben Lösung in eine tiefblaue Farbe an, andernfalls ändert sich die Farbe nicht. Nach Fertigstellung der PNA-Sequenz erfolgte die N-terminale Modifikation mit TPA mit einem leicht modifizierten Kopplungsverfahren. TPA wurde durch Inkubation des Harzes mit einer Mischung enthaltend 4 Äq. gekoppelt. Mono-tert-butylterephthalat, 4 Äq. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), 4 Äq. Benzotriazol-1-yloxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) und 8 Äq. DIPEA wurde 10 Minuten lang bei \(70\,^{\circ }\hbox {C}\) in DMF gelöst (Mikrowellenbestrahlung). N-terminale Essigsäure wurde durch einen Acetylierungsschritt wie oben beschrieben eingeführt. Abschließend wurde das Harz dreimal mit DMF und dreimal mit DCM gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet und bis zur Spaltung und Aufarbeitung des PNA-Konstrukts in einem luftdichten Behälter bei \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) gelagert.

PNA-Produkte wurden von zuvor getrocknetem Harz durch Zugabe eines Spaltungscocktails, der 2,85 ml Trifluoressigsäure (TFA), 75 μl Triisopropylsilan (TIS) und 75 μl Wasser enthielt, abgespalten. Das Harz wurde 90 Minuten lang mit einem Spaltungscocktail gerührt. Die Spaltungslösung wurde zu 45 ml einer vorgekühlten Mischung aus Methyl-tert-butylether (MTBE) und n-Hexan 1:1 (Vol./Vol.) in einem 50-ml-Reaktionsgefäß gegeben, das 5 Minuten lang bei 30 °C zentrifugiert wurde 4000 U/min (Megafuge 1.0 R, Heraeus, Hanau, Deutschland). Der Überstand wurde entfernt und das PNA-Pellet unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 30 % Acetonitril in Wasser gelöst und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Gefriertrocknung wurde mit einem Christ Alpha 2–4 ​​LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Deutschland) durchgeführt. Das Produkt wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-10-Säule, die an ein Äkta-Reinigungssystem (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Schweden) angeschlossen war, und 30 % Acetonitril in Wasser als mobile Phase gereinigt. Die durchschnittliche Ausbeute der PNA-Synthese lag bei etwa 60 %.

Die Proben wurden auf einen MTP AnchorChip (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) aufgetragen, indem zunächst 1 μl einer gesättigten Super-DHB-Matrixlösung (2,5-Dihydroxybenzoesäure und 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure) kristallisiert wurden. , gefolgt von der Zugabe von 1 \(\upmu\)L Probenlösung. Nach dem Trocknen wurden Massenspektren im Positivmodus mit einem Autoflex II-Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) aufgenommen.

Die PNA-Zr-Partikelsynthese erforderte einen zweistufigen Prozess, um den Zusammenbau bei RT zu ermöglichen und ein Schmelzen der PNA-Duplexe zu vermeiden. Als Grundlage für die Adaption66 diente eine zuvor beschriebene Methode zur Synthese von UiO-66 bei RT. Der erste Schritt war die Bildung von Zr-Knoten, die durch Mischen von 71 \(\upmu\)L einer 70 Gew.-%igen Zirkonium(IV)propoxidlösung in 1-Propanol (0,0519 g, 0,158 mmol) und 7 ml DMF erreicht wurde und 4 ml Essigsäure in einem verschlossenen Glasbehälter. Die Lösung wurde 2 Stunden lang auf \(130\,^{\circ }\hbox {C}\) erhitzt. Dann wurde ein merklicher Farbumschlag von farblos nach gelb beobachtet. Die Lösung konnte auf RT abkühlen, bevor mit dem zweiten Schritt fortgefahren wurde. Doppelsträngige PNA-Linker wurden einem Annealing-Prozess unterzogen, indem die beiden komplementären Stränge im äquimolaren Verhältnis (nur 1 Strang bei palindromischen Sequenzen) in wässriger Lösung kombiniert und auf \(90\,^{\circ }\hbox { C}\) über 30 Min. und Abkühlen auf RT über 30 Min. Dann wurden 30 % Acetonitril zugegeben, die Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und gefriergetrocknet. PNA-Linker wurden je nach Löslichkeit in Konzentrationen von 1–4 mg/ml in DMF gelöst. Schließlich wurde die vorgeformte Zr-Knotenlösung mit dem PNA-Linker im äquimolaren Verhältnis gemischt. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei RT unter Rühren inkubiert. Die gebildeten PNA-Zr-Partikel wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 4000 U/min von der Lösung abgetrennt und dreimal durch wiederholtes Resuspendieren in DMF und Zentrifugieren gewaschen. Anschließend wurden die Partikel zweimal mit Ethanol gewaschen, in 1 ml Ethanol resuspendiert und bei \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) gelagert.

Die PNA-Einkapselungseffizienz (EE) in Zr-Nanopartikeln wurde durch Quantifizierung der molekularen Menge an PNA über UV-Absorption bei 260 nm (164,3 ml/(\(\upmu\)mol \(\times\) cm) Extinktionskoeffizient für 705 SSO PNA bestimmt ). Nach der Bildung von PNA-Zr-Nanopartikeln wurden die Partikel durch Phosphatkonkurrenz zersetzt und die anfängliche Menge an freigesetztem PNA wurde gemäß der folgenden Formel auf die Menge an PNA normalisiert, die für die Synthese verwendet wurde:

Eine Menge von ca. 2 mg trockene PNA-Zr-Partikel wurden für die XRD-Messung mit einem STOE-Transmissionsdiffraktometersystem Stadi MP mit Cu K\(\alpha\)1-Strahlung (\(\lambda\) = 1,54060 Å) und einem Ge (111)-Einkristall verwendet Monochromator. Beugungsmuster wurden mit einem DECTRIS-Festkörperstreifendetektor MYTHEN 1K (Schrittgröße von \(4,71\,^{\circ }\), Zählzeit von 120 s pro Schritt) aufgezeichnet. Die generierten Daten wurden mit WinXPOW RawDat v3.0.2.5 analysiert.

Ungefähr 20 mg trockene PNA-Zr-Partikel wurden 38 Stunden lang bei RT im Hochvakuum entgast. Die Stickstoffsorptionsisothermen wurden mit einer Autosorb iQ Station 1 bei \(-195,8\,^{\circ }\hbox {C}\) gemessen und die generierten Daten mit der Software ASiQwinTM (Version 3.0, Quantachrome Instruments) ausgewertet. Die Oberfläche der Proben wurde mithilfe der linearisierten Brunauer-Emmett-Teller-Gleichung (BET) berechnet. Die Porengrößen wurden gemäß dem Kohlenstoffmodell der Dichtefunktionaltheorie abgeschreckter Feststoffe (bei -195,8\,^{\circ }\hbox {C}\), Stickstoff und einem relativen Druck zwischen 0 und 1 atm berechnet.

Die Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES) wurde mit drei unabhängigen Proben durchgeführt. Die Proben wurden zunächst 24 Stunden lang vakuumgetrocknet, gefolgt von einer 4-stündigen Trocknung bei \(90\,^{\circ }\hbox {C}\). Der Aufschluss erfolgte mit 69 % HNO3 in Wasser bis zur vollständigen Auflösung. Anschließend wurden die Proben mit 3 % HNO3 in bidestilliertem Wasser verdünnt und der Zr-Gehalt mittels ICP-AES (CCD simultanes ICP AES Vista RL von Agilent, Wellenlängen 257,2, 327,3, 339,2, 343,8 und 349,7, Saugzeit 35 s, Stabilisierung) gemessen Zeit 45 s, Leistung 1,25 kW). Der Durchschnitt des Verhältnisses von Zr zur Gesamtmasse von drei Proben wurde berechnet.

Größen- und Zetapotentialmessungen wurden mit einem Zetasizer Nano ZS mit Rückstreuerkennung (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) unter Verwendung gefalteter Kapillarküvetten DTS1070 durchgeführt. PNA-Zr-Partikel wurden vor den Messungen 5 Minuten lang beschallt. Zur Größen- und PDI-Bestimmung wurden etwa 2,5 μg PNA-Zr-Partikel zu 125 μl destilliertem Wasser gegeben. Der Brechungsindex wurde auf 1,330 und die Viskosität auf 0,8872 cP eingestellt. Die Messungen wurden bei RT mit 1 Minute Äquilibrierungszeit und mindestens 6 Teilläufen durchgeführt. Anschließend wurden den Proben 835 \(\upmu\)L 10 mM NaCl zur Bestimmung des Zetapotentials mittels ELS zugesetzt. Die Proben wurden dreimal bei RT mit einer Äquilibrierungszeit von 1 Minute und mindestens 12 Unterläufen gemessen. Zetapotentiale wurden automatisch basierend auf der Smoluchowski-Gleichung berechnet.

Stammlösungen von PNA-Zr-Partikeln wurden verwirbelt und 1:10 mit Ethanol verdünnt. Die verdünnten Lösungen wurden auf die hydrophobe Oberfläche eines REM-Probenhalters getüpfelt. Getrocknete Proben wurden durch drei Zyklen der Kohlenstoffvakuumabscheidung mit einer Kohlenstoffschicht überzogen. SEM-Messungen wurden mit einem Dual-Beam-REM FEI Helios G3 UC durchgeführt, das bei 3 kV betrieben wurde.

Die Stabilität von PNA-Zr-Partikeln in Gegenwart von HBG und HEPES wurde durch photometrische Messung der optischen Dichte von Partikelsuspensionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden etwa 50 \(\upmu\)L PNA-Zr-Stammlösungen in Ethanol in Quarzküvetten mit 2 ml HBG oder HEPES gegeben. Das gleiche Volumen Ethanol wurde mit HBG oder HEPES als Blindkontrollen in separate Küvetten gegeben. Die Absorption der Proben bei 400 nm wurde in 1-Minuten-Intervallen über 1 Stunde überwacht. Die Daten wurden mit einem Cary 3500 UV-Vis-Spektrophotometer (Agilent Technologies, USA) unter ständigem Rühren gesammelt. Zur Beurteilung der thermischen Stabilität wurden PNA-Zr-Partikel in 2 ml Wasser gegeben. Das gleiche Volumen Ethanol wurde in separate Küvetten mit Wasser als Blindkontrolle gegeben. In den Küvetten wurden Temperatursonden platziert und die Proben einem Temperaturgradienten zwischen \(25\,^{\circ }\hbox {C}\) und \(70\,^{\circ }\hbox {C} ausgesetzt. \) mit einer Zunahme von \(1\,^{\circ }\hbox {C}\) pro Minute. Die Absorption der Proben bei 400 nm wurde nach jedem Temperaturanstieg um \(0,5\,^{\circ }\hbox {C}\) gemessen. Die Daten wurden mit einem Cary 3500 UV-Vis-Spektrophotometer (Agilent Technologies, USA) unter ständigem Rühren gesammelt. Die Partikelstabilität in verschiedenen Verdünnungen von PBS und in 20 % FBS wurde auf ähnliche Weise durch photometrische Messung der optischen Dichte von Partikelsuspensionen untersucht. Es wurden verschiedene PBS-Verdünnungen hergestellt und etwa 50 μl PNA-Zr-Partikelsuspension zu 2 ml Lösung in Quarzküvetten gegeben. Das gleiche Volumen Ethanol wurde mit PBS-Verdünnung als Blindkontrolle in separate Küvetten gegeben. Für die Stabilitätsbestimmung in Gegenwart von Serum wurde 20 % FBS in Wasser hergestellt und 50 µl PNA-Zr-Partikelsuspension zu 2 ml 20 % FBS gegeben. Als Leerwert wurden 2 ml 20 % FBS mit 50 \(\upmu\)L Ethanol verwendet. Die Absorptionswerte der Proben bei einer Wellenlänge von 400 nm wurden 1 Stunde lang jede Minute bestimmt. Die Datenerfassung erfolgte automatisch mit einem Cary 3500 UV-Vis-Spektrophotometer (Agilent Technologies, USA) unter kontinuierlichem Rühren.

HeLa pluc/705- und HeLa-Wildtyp-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedrigem Glucosegehalt (1 g/L Glucose) kultiviert. DMEM wurde mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen wurden in belüfteten Kolben im Inkubator bei \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) und 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre kultiviert.

Das künstliche Lipopeptid LP LenA, das zuvor zur Konjugation mit Spleiß-schaltenden PMOs78 verwendet wurde, wurde zur Beschichtung von PNA-Zr-Nanopartikeln verwendet. LP LenA wurde durch Festphasensynthese synthetisiert und hat die Sequenz Kε(N3)-Y3-Stp2-Kε[G-Kα,ε(Linolensäure)2]-Stp2-Y3 (Y: Tyrosin; Stp: Succinyl-Tetraethylenpentamin; K: Lysin; G: Glycin; Kε(N3): Azidolysin). Der 705 SSO PNA-Gehalt von Nanopartikeln wurde durch Zerlegen einer kleinen Probe durch Konkurrenz mit PBS und photometrische Quantifizierung der freigesetzten PNA bei 260 nm (164,3 ml/(\(\upmu\)mol \(\times\) cm) Extinktionskoeffizienten bestimmt ). Basierend auf dem ermittelten PNA-Gehalt wurden die Nanopartikel vor der weiteren Verdünnung in HBG 40 Minuten lang mit stöchiometrischen Mengen des Lipopeptids LP LenA inkubiert.

PNA mit der Sequenz H-CCTCTTACCTCAGTTACA-NH\(_{2}\) (1 Äq.) wurde in 500 \(\upmu\)L wasserfreiem DMSO mit 10 Äquivalenten DIPEA gelöst. DBCO-NHS (5 Äquivalente) in 250 μl wasserfreiem DMSO wurde zur PNA-Lösung gegeben und über Nacht bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Probe durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung eines Äkta-Reinigungssystems (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Schweden), einer Sephadex G-10-Säule und 30 % Acetonitril in Wasser als mobile Phase gereinigt. Die gepoolten Produktfraktionen wurden gefriergetrocknet und bei \(\hbox {-}20\,^{\circ }\hbox {C}\) gelagert. Einen Tag vor dem Zellexperiment wurden eine 100 μM PNA-DBCO-Lösung in HBG, ergänzt mit 0,04 M HCl, und eine 300 μM LP-LenA-Lösung in HBG hergestellt. Gleiche Volumina beider Lösungen wurden kombiniert und über Nacht bei RT unter Schütteln bei 300 U/min inkubiert. Für Zellexperimente wurde die PNA-Konjugatformulierung mit HBG auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt.

Das Protokoll des Herstellers für Plasmid-DNA-Transfektionen (pDNA) mit Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, USA) wurde an PNA-Behandlungen angepasst. Es wurde die erforderliche Menge an Lipofectamine 3000 und P3000 für 200 ng pDNA pro Vertiefung verwendet. Bei einer festen Lipofectamine 3000-Menge wurde die Menge an 705 SSO PNA variiert, um Transfektionslösungen von 50 \(\upmu\)M, 25 \(\upmu\)M, 12,5 \(\upmu\)M, 6,25 \(\ upmu\)M, 3,125 \(\upmu\)M und 1,5625 \(\upmu\)M. P3000 und die erforderliche Menge an 705 SSO PNA wurden in 25 μl serumfreiem DMEM kombiniert. 1 µL Lipofectamine 3000 wurde in 25 µL serumfreiem DMEM verdünnt und mit der Lösung, die P3000 und PNA enthielt, kombiniert. Die gemischte Lösung wurde 15 Minuten bei RT inkubiert.

HeLa pluc/705-Zellen wurden 24 Stunden vor den Behandlungen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von \(5\times 10^{3}\) Zellen pro Well ausgesät. Die Zellbehandlung wurde durch Ersetzen des Mediums durch 90 μl frisches serumhaltiges DMEM eingeleitet und 10 μl PNA-Formulierungen wurden in jede Vertiefung gegeben. Nach 48-stündiger Inkubation (oder alternativen Inkubationszeiten, wie in kinetischen Studien angegeben) wurde das Medium entfernt und 100 µl Lysepuffer (Promega, Mannheim, Deutschland) in jede Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden 45 Minuten lang bei RT mit Lysepuffer inkubiert. Die Luciferase-Aktivität in 35 μl Zelllysat wurde mit Luciferin-LAR-Pufferlösung (1 mM Luciferin, 20,94 mM Glycylglycin, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 3,29 mM DTT, 0,55 mM ATP, 0,28 mM Coenzym) gemessen Eine Stammlösung, pH 8,0–8,5) unter Verwendung eines Plattenlese-Luminometers Centro LB 960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland). Die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden auf HBG-behandelte Zellen normalisiert und die Ergebnisse werden als „fache Zunahme der Lumineszenz“ dargestellt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Wildtyp-Zellen wurde mittels CellTiter-Glo\(^\circledR\)-Assay nach Behandlung mit PNA-Zr-Partikeln untersucht. HeLa-Zellen wurden 24 Stunden vor den Behandlungen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von \(5 \times 10^{3}\) Zellen pro Well ausgesät. Dann wurde das Medium durch 90 μl frisches serumhaltiges DMEM ersetzt und 10 μl PNA-Zr-Partikel in jede Vertiefung gegeben. Nach 48 Stunden wurde das Medium entfernt und 25 μl DMEM und 25 μl CellTiter-Glo-Reagenz (Promega, Mannheim, Deutschland) hinzugefügt jeder gut. Die Wellplatten wurden 30 Minuten lang bei RT unter Schütteln inkubiert und die Biolumineszenz wurde mit einem Plattenlese-Luminometer Centro LB 960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) gemessen. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die relativen Stoffwechselaktivitäten wurden durch Normalisierung auf HBG-behandelte Kontrollvertiefungen gemäß der folgenden Formel berechnet:

HeLa pluc/705-Zellen wurden 24 Stunden vor den Behandlungen in Platten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von \(5 \times 10^{4}\) Zellen pro Vertiefung ausgesät. Dann wurde das Medium durch 900 μl frisches serumhaltiges DMEM ersetzt und 100 μl Partikelsuspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden 48 Stunden lang inkubiert, dann wurde das Medium entfernt und die vollständige RNA-Isolierung wurde mit Tri-Reagent\(^\circledR\) (Sigma-Aldrich) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Ein Hochleistungs-cDNA-Reverse-Transkriptionskit (Applied Biosystems) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet, um die isolierte RNA revers in cDNA zu transkribieren. Die Standard-PCR wurde mit 300 ng cDNA unter Verwendung des HotStarTaq Plus DNA-Polymerase-Kits (QIAGEN) und der folgenden Primer durchgeführt: 5\(^{\prime }\)-TTGATATGTGGATTTCGAGTCGTC-3\(^{\prime }\) (forward ) und 5\(^{\prime }\)-TGTCAATCAGAGTGCTTTTGGCG-3\(^{\prime }\) (umgekehrt). Das PCR-Programm bestand aus einem ersten Zyklus bei \(95\,^{\circ }\hbox {C}\) für 5 Minuten, gefolgt von 29 Zyklen mit \(95\,^{\circ }\hbox {C} \) für 30 s, \(55\,^{\circ }\hbox {C}\) für 30 s, \(72\,^{\circ }\hbox {C}\) für 30 s und schließlich eins Zyklus bei \(72\,^{\circ }\hbox {C}\) für 10 Minuten. Das RT-PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese (1,25 % Agarose in TBE-Puffer mit GelRed\(^\circledR\)) bei 90 V für 45 Minuten analysiert.

PNA-Zr-Partikelsuspensionen in Ethanol wurden zentrifugiert und die Überstände entfernt. Die Partikel wurden in 1 ml 0,25 mM Calceinlösung in Wasser resuspendiert und auf einem Schüttler 15 Minuten lang bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Partikel zentrifugiert und dreimal mit Wasser, dreimal mit Ethanol gewaschen und in Ethanol gelagert. 50 bis 100 µl Calcein-markierte PNA-Zr-Suspensionen wurden durch Konkurrenz mit 1 ml PBS zerlegt. Der PNA- und Calcein-Gehalt wurde photometrisch mit einem Cary 3500 UV-Vis-Spektrophotometer bei 260 nm (PNA) bzw. 515 nm (Calcein) quantifiziert. Für PNA-Zr-Partikel auf Basis von GCATGC-TPA wurde ein PNA:Calcein-Verhältnis von 100:1,22 (w/w), basierend auf PAMBA-GCAGCT-TPA ein Verhältnis von 100:1,32 (w/w) ermittelt.

Um die zelluläre Aufnahme von Calcein-beladenen Partikeln zu untersuchen, wurden HeLa pLuc/705-Zellen in 8 Well-Ibidi \(\upmu\)-Objektträgern (Ibidi GmbH, Planegg/Martinsried, Deutschland) mit einer Dichte von \(2 \times 10^) ausgesät {4}\) Zellen pro Vertiefung 24 Stunden vor den Behandlungen. Dann wurde das Medium durch 240 μl frisches serumhaltiges DMEM und 60 μl Calcein-markierte PNA-Zr-Partikel ersetzt. Die Zellen wurden 4 Stunden lang mit Partikeln inkubiert, dann wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Inkubation wurde 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 300 μl/Vertiefung 4 % Paraformaldehyd für 45 Minuten bei RT fixiert. Jede Vertiefung wurde zweimal mit PBS gewaschen und der Objektträger wurde über Nacht bei \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) in PBS gelagert. Die Zellfärbung erfolgte durch Inkubation mit 300 μl PBS, das DAPI (2 μg/ml) zur Färbung von Kernen und Phalloidin-Rhodamin (1 μg/ml) enthielt. zur Färbung des Aktin-Zytoskeletts für 30 Minuten bei RT in einer lichtgeschützten Umgebung. Die Färbelösung wurde entfernt und durch 300 μl PBS ersetzt.

Um die Wirkung von mit LP LenA beschichteten Partikeln auf die Integrität der endosomalen Membran zu bewerten, wurden HeLa mRuby3/gal8-Reporterzellen verwendet,87 die auf dem Konstrukt PB-CAG-mRuby3-Gal8-P2A-Zeo von Jordan Green (Addgene-Plasmid Nr. 150815) basieren ; http://n2t.net/addgene:150815; RRID:Addgene_150815). Für die Bewertung wurden \(2\times 10^{4}\) HeLa mRuby3/gal8-Zellen in 300 \(\upmu\)L DMEM-Medium in 8 Well-Ibidi \(\mu\)-Objektträgern ausgesät. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) und 5 % CO2 inkubiert. Dann wurde das Medium entfernt und 270 μl frisches Medium und 30 μl LP-LenA-beschichtete (Molverhältnis 1/1,25) oder unbeschichtete 705 SSO-Zr-Partikelsuspensionen mit 25 μm hinzugefügt. )M PNA wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Zellen wurden 8 Stunden lang mit Partikeln inkubiert, dann wurden die Lösungen entfernt und die Inkubation wurde mit frischem Medium 4 Stunden lang fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und jede Vertiefung mit 300 μl 4 % Paraformaldehyd für 45 Minuten bei RT fixiert. Nach der Fixierung wurden die Vertiefungen erneut zweimal mit PBS gewaschen und in PBS bei \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) gelagert. Die Färbung der Kerne erfolgte durch 30-minütige Inkubation (bei RT in einer lichtgeschützten Umgebung) mit 300 μl PBS-Lösung, die DAPI (2 μg/ml) enthielt. Die Färbelösung wurde entfernt und durch 300 μl PBS ersetzt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica-TCS-SP8 aufgenommen, das mit einem HC PL APO 63x 1,4-Objektiv (Deutschland) und der LAS X-Software von Leica ausgestattet war. Die DAPI-Emission wurde bei 460 nm, Calcein bei 530 nm, Phalloidin-Rhodamin bei 580 nm und mRuby3 bei 585 nm aufgezeichnet.

Die Ergebnisse werden als arithmetisches Mittel ± Standardabweichung dargestellt. Die Signifikanzniveaus wurden durch einen zweiseitigen T-Test (ungepaart) bewertet. Die folgenden Symbole werden verwendet, um Signifikanzniveaus anzuzeigen: *p \(\le\) 0,05, **p \(\le\) 0,01, ***p \(\le\) 0,001, ****p \( \le\) 0,0001 und 'ns' für nicht signifikant.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Open-Access-Förderung der Universität Wien. EW bedankt sich für die Unterstützung durch das Teilprojekt B4 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB1032 (Projekt-ID 201269156). Ö.Ö. schätzen die vom türkischen Bildungsministerium gewährten YLSY-Stipendien zur Unterstützung seiner Doktorarbeit. Studium an der Ludwig-Maximilians-Universität München. UL freut sich über die Unterstützung der Galenus-Stiftung (Wien, Österreich). Wir danken Teoman Benli-Hoppe, Simone Berger und Tobias Burghardt für die Durchführung von MALDI-TOF-Massenspektrometriemessungen, Surhan Göl Öztürk für die Hilfe bei Zellkulturen, Steffen Schmidt für SEM-Messungen, Shizhe Wang für XRD-Messungen und Faqian Shen für FT-IR-Messungen. Die TOC-Abbildung, Schema 1 und die grafischen Elemente in Abb. 4 wurden mit Biorender.com erstellt.

Department für Pharmazie und Center for NanoScience (CeNS), LMU München, 81377, München, Deutschland

Özgür Öztürk, Anna-Lina Lessl, Miriam Höhn, Ernst Wagner & Ulrich Lächelt

Abteilung für Gen- und Biotechnik, Alanya Alaaddin Keykubat Universität, Antalya, Türkiye

Özgür Öztürk

Baskisches Zentrum für Materialien (BCMaterials), Leioa, Spanien

Stefan Wuttke

Ikerbasque, Baskische Stiftung für Wissenschaft, Bilbao, Spanien

Stefan Wuttke

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Medizin, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Peter E. Nielsen

Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Wien, Wien, Österreich

Ulrich Lächelt

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Ö.Ö.: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf. A.-LL: Methodik, Untersuchung. MH: Methodik, Untersuchung. SW: Konzeptualisierung, Schreiben – Originalentwurf. PEN: Konzeptualisierung, Schreiben – Originalentwurf. EW: Konzeptualisierung, Betreuung, Finanzierungseinwerbung, Schreiben – Originalentwurf. UL: Konzeptualisierung, Betreuung, Finanzierungseinwerbung, Schreiben – Originalentwurf.

Correspondence to Ulrich Lächelt.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Öztürk, Ö., Lessl, AL., Höhn, M. et al. Peptidnukleinsäure-Zirkonium-Koordinationsnanopartikel. Sci Rep 13, 14222 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40916-w

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Eingegangen: 19. Dezember 2022

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40916-w

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