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Jul 04, 2023

Bewertung des MxOy/Fucoidan-Hybridsystems und seiner Anwendung im Lipase-Immobilisierungsprozess

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 7218 (2022) Diesen Artikel zitieren 915 Zugriffe 4 Zitate Metrikdetails Eine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 23. November 2022 veröffentlicht. Dieser Artikel

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In dieser Arbeit wurden neue MxOy/Fucoidan-Hybridsysteme hergestellt und bei der Lipaseimmobilisierung eingesetzt. Als anorganische MxOy-Matrizen wurden Magnesium- (MgO) und Zirkoniumoxide (ZrO2) verwendet. Im ersten Schritt wurden die vorgeschlagenen Oxide mit Fucoidan aus Fucus vesiculosus (Fuc) funktionalisiert. Die erhaltenen MgO/Fuc- und ZrO2/Fuc-Hybride wurden mittels spektroskopischer Analysen, einschließlich Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie, Röntgenphotoelektronenspektroskopie und Kernspinresonanz, charakterisiert. Zusätzlich wurde eine thermogravimetrische Analyse durchgeführt, um die thermische Stabilität der Hybride zu bestimmen. Basierend auf den Ergebnissen wurde auch der Mechanismus der Wechselwirkung zwischen den Oxidträgern und Fucoidan bestimmt. Darüber hinaus wurden die hergestellten MxOy/Fucoidan-Hybridmaterialien als Träger für die Immobilisierung von Lipase aus Aspergillus niger verwendet und eine Modellreaktion (Umwandlung von p-Nitrophenylpalmitat in p-Nitrophenol) durchgeführt, um die katalytische Aktivität des vorgeschlagenen biokatalytischen Systems zu bestimmen . Bei dieser Reaktion zeigte die immobilisierte Lipase eine hohe scheinbare und spezifische Aktivität (145,5 U/g Katalysator und 1,58 U/mg Enzym für auf MgO/Fuc immobilisierte Lipase; 144,0 U/g Katalysator und 2,03 U/mg Enzym für auf ZrO2/Fuc immobilisierte Lipase). Die Immobilisierungseffizienz wurde auch mithilfe spektroskopischer Analysen (FTIR und XPS) und konfokaler Mikroskopie bestätigt.

In den letzten Jahrzehnten ist die Entwicklung kostengünstiger, biologisch abbaubarer und leicht verfügbarer natürlicher Materialien für verschiedene Anwendungen für eine große Zahl von Forschern von größerem Interesse geworden. Es ist äußerst wünschenswert, dass die Trägermatrix, die das Enzym bindet, reproduzierbar hergestellt werden kann und die Enzymaktivität nicht stört, da sie für die technologische Leistung und den kommerziellen Erfolg von großer Bedeutung ist1,2,3. Allerdings haben diese Materialien auch einige Nachteile (geringe mechanische Festigkeit und begrenzte thermische Stabilität), die durch geeignete Modifizierungsverfahren verbessert werden können4,5.

Biopolymere sind aufgrund ihrer vielseitigen Eigenschaften, darunter Ungiftigkeit, Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit, Flexibilität und Erneuerbarkeit, vielversprechende Träger für die Enzymimmobilisierung6,7,8. Darüber hinaus sind in ihrer chemischen Struktur zahlreiche reaktive funktionelle Gruppen wie Hydroxyl-, Amino- oder Carbonsäuregruppen vorhanden. Diese ermöglichen es Enzymen, sich mit dieser Struktur zu verbinden7,9. Bisher wurden verschiedene natürliche Polysaccharide wie Cellulose10,11, Chitin12,13, Chitosan14,15, Alginat16,17, Agarose18,19,20 und Carrageenan21,22 als Enzymträger verwendet. In letzter Zeit wird mehr Aufmerksamkeit auf Biopolymer/anorganische Matrix-Komposite oder Hybride gelegt, die auch bei der Enzymimmobilisierung verwendet werden können7. Hohe Beständigkeit, Stabilität und Verfügbarkeit sind die wichtigsten Parameter anorganischer Materialien, insbesondere ausgewählter Oxide (SiO2, ZnO, ZrO2, MgO usw.)23. Darüber hinaus können sie mit einfachen und schnellen Methoden synthetisiert werden, was sie relativ kostengünstig macht. Es sollte auch beachtet werden, dass Biopolymere auf der Oberfläche von Metalloxiden eingeführt werden können, um deren Affinität zu Enzymen zu erhöhen7,24. In der Literatur gibt es zahlreiche Informationen zu Materialien auf Basis von Chitosan/Chitin/Cellulose und anorganischen Oxiden und deren Anwendung bei der Enzymimmobilisierung25,26,27,28.

Natürliche Polysaccharide spielen in der Pharma- und Kosmetikindustrie eine wichtige Rolle. Sie werden häufig aus Algen gewonnen, darunter auch Braunalgen29,30. Braunalgen (Phaeophyta) sind eine Gruppe von Algen mit einem sehr hohen Grad an Spezialisierung auf die Struktur des Thallus, der meist die Form eines verzweigten Fadens hat31,32,33. Algen sind eine Quelle potenziell bioaktiver Polysaccharide, unter denen Fucoidan, das aus Braunalgen (insbesondere aus Fucus-Arten und Geweben von Stachelhäutern) gewonnen wird, derzeit die Verbindung ist, die derzeit am ausführlichsten untersucht wird34,35. Fucoidan kann aus einer Reihe von Meeresquellen gewonnen werden, darunter Seegurken36 und Braunalgen37. Ein hoher Fucoidan-Gehalt wurde bei einer Vielzahl von Algen und Wirbellosen festgestellt, beispielsweise bei Fucus vesiculosus, Sargassum stenophyllum, Chorda filum, Ascophyllum nodosum, Dictyota menstrualis, Fucus evanescens, Fucus serratus, Fucus distichus, Caulerpa racemosa, Hizikia fusiforme, Padina gymnospora, Kjellmaniella crassifolia, Analipus japonicus und Laminaria hyperborea. In diesen Quellen sind verschiedene Arten von Fucoidan vorhanden, und zu ihrer Gewinnung werden verschiedene Extraktionsmethoden verwendet38.

Fucoidan besteht aus α-L-Fucopyranose-Molekülen, die durch 1→3-Bindungen oder durch abwechselnde 1→3- und 1→4-Bindungen verbunden sein können. Um die verzweigte Struktur in der Hauptkette zu erhalten, werden Radikale von α-l-Fucopyranose sowie anorganische Sulfat(VI)-Radikale und organische Radikale wie d-Glucuronsäure und Acetyl angehängt. Einige der Fucoidan-Strukturen enthalten auch geringe Mengen verschiedener anderer Monosaccharide, z. B. Glucose, Galactose, Xylose und/oder Mannose39,40,41,42. Fucoidan bietet eine Vielzahl biologischer Eigenschaften, darunter antibakterielle, antioxidative, antivirale, entzündungshemmende, gerinnungshemmende und krebsbekämpfende Eigenschaften43,44,45. Darüber hinaus ist Fucoidan biokompatibel, biologisch abbaubar und ungiftig46,47.

Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften ist Fucoidan ein vielversprechendes Biopolymer, das auch als Beschichtungsmaterial eingesetzt werden kann. Bisher wurden Fucoidan-modifizierte Materialien in medizinischen Anwendungen wie der Arzneimittelverabreichung eingesetzt48,49,50,51,52. Das magnetische mesoporöse Siliciumdioxidsystem wurde von Moorthy et al.48 mit Fucoidan modifiziert. Fucoidan wurde durch eine Metall-Ligand-Komplex-Koordinationstechnik auf die Siliciumdioxidoberfläche aufgebracht. Das vorgeschlagene Material wurde als Arzneimittelträger und als Hyperthermiemittel für Chemotherapie- und magnetische Hyperthermie-basierte Wärmetherapieanwendungen in der Therapie neu auftretender Krebserkrankungen eingesetzt. In anderen Studien wurde Fucoidan auf CuS-Nanopartikel aufgetragen und in der chemophotothermischen Therapie gegen Krebszellen eingesetzt49. In diesem Fall wurde Fucoidan durch eine Schicht-für-Schicht-Technik unter Verwendung polykationischer und anionischer Verbindungen auf die CuS-Oberfläche eingebracht. In einer anderen Studie entwickelten Shin et al.50 Fucoidan-beschichtete Mangandioxid-Nanopartikel (Fuco-MnO2-NPs) und testeten sie in der klinischen Behandlung von Krebs. Die MnO2-NPs wurden durch die Adsorptionsmethode mit Fucoidan beschichtet. Venkatesan et al.51 verwendeten einen Fucoidan-Chitosan-Komplex zur Modifizierung von Silbernanopartikeln (AgNP). Dieses System hat ein großes Potenzial für Lebensmittel- und Kosmetikanwendungen. Ein anderes Forschungsteam entwarf bimodale Fucoidan-beschichtete Zinkoxid/Eisenoxid-Nanopartikel für medizinische Anwendungen52.

Bisher wurden mit Fucoidan modifizierte anorganische Materialien nicht als Träger für die Enzymimmobilisierung untersucht. Daher wurden in dieser Studie ausgewählte anorganische MxOy-Verbindungen (ZrO2 und MgO) mit Fucoidan (Fuc) modifiziert. Ein Hauptziel bestand darin, die Modifikation von MxOy mit Fucoidan mithilfe einer Reihe spektroskopischer Analysen zu bestätigen – Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS). Zusätzlich wurde eine thermogravimetrische Analyse (TG/DTG) durchgeführt. Die vorbereiteten MxOy/Fuc-Materialien wurden dann als Träger für Lipase verwendet. Die Menge der immobilisierten Lipase, die katalytische Aktivität und konfokale mikroskopische Bilder wurden analysiert, um den Erfolg der Immobilisierung zu bestätigen.

Die folgenden Materialien wurden in der Studie verwendet: Zirkoniumisopropoxid (TPZ), 25 % Ammoniaklösung (NH3aq.), Ethylalkohol (EtOH), Magnesiumoxidpulver, Fucoidan aus Fucus vesiculosus (Fuc), Lipase aus Aspergillus niger (LAN), Natriumphosphat (NaH2PO4), dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4), p-Nitrophenylpalmitat (p-NPP), p-Nitrophenol (p-NP), 2-Propanol, Triton X-100 und arabisches Gummi. Alle diese Materialien wurden von Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) gekauft.

Das in diesen Studien verwendete hochreine Magnesiumoxidpulver (98 %) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. ZrO2 wurde mit der Sol-Gel-Methode synthetisiert. In diesem Fall wurden Zirkoniumisopropoxid und Ammonium in einen Reaktor mit Ethanol dosiert. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Der nächste Schritt der Synthese war die Kristallisation (Alterung; 24 h). Das resultierende Zirkonoxid (ZrO2) wurde mit Wasser gewaschen, filtriert und anschließend bei 105 °C getrocknet.

Im nächsten Forschungsstadium wurden ZrO2 und MgO mit Fucoidan modifiziert. Zu diesem Zweck wurde die wässrige Lösung von Fucoidan (1 mg/ml) hergestellt, 1 g des entsprechenden Oxids zu der Fucoidan-Lösung (10 ml) gegeben und 24 Stunden lang magnetisch gerührt. Das resultierende MxOy/Fuc-Hybridsystem wurde filtriert und bei 60 °C getrocknet. Die erhaltenen Proben wurden mit ZrO2/Fuc und MgO/Fuc gekennzeichnet.

Um sowohl die Funktionalisierung von ZrO2 und MgO mit Fucoidan als auch den Immobilisierungsprozess zu bestätigen, wurden spektroskopische Analysen durchgeführt: Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Kernspinresonanz (1H- und 13C-NMR) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS). Eine detaillierte Beschreibung dieser Analysen finden Sie in den ergänzenden Materialien.

Die thermogravimetrische Analyse (TG/DTG) wurde mit einem thermogravimetrischen Analysegerät Jupiter STA 449F3 (Netzsch, Deutschland) durchgeführt. Die Messungen wurden unter fließendem Stickstoff bei einer Heizrate von 5 °C/min und in einem Temperaturbereich von 30 bis 1000 °C bei einem anfänglichen Probengewicht von ca. 5 mg durchgeführt.

ZrO2/Fuc und MgO/Fuc wurden als Träger für die Lipaseimmobilisierung verwendet. Der Prozess wurde durch ein Adsorptionsverfahren durchgeführt. Eine bestimmte Menge Matrix wurde mit der Lipaselösung (5 mg/ml, Phosphatpuffer bei pH = 7) in einem Inkubator (20 °C, IKA-Werke, Staufen, Deutschland) 24 Stunden lang geschüttelt. Anschließend wurde das vorbereitete biokatalytische System (ZrO2/Fuc/LAN oder MgO/Fuc/LAN) durch Filtration abgetrennt. Die Bradford-Analyse53 wurde verwendet, um das Ergebnis des Immobilisierungsprozesses zu bestätigen und die Menge an immobilisierter Lipase (PLAN, mgEnzym/gUnterstützung) und die Immobilisierungsleistung (PI, %) zu berechnen. Im nächsten Schritt wurde die enzymatische Aktivität der immobilisierten Lipase bewertet. Als Modellreaktion diente die Umwandlung von p-NPP (p-Nitrophenylpalmitat) in p-NP (p-Nitrophenol). Die Freisetzung des Produkts wurde bei 410 nm beobachtet (unter Verwendung eines JASCO V650-Spektrophotometers, Japan). Alle Reaktionen (dreifach durchgeführt) wurden unter Rühren bei 1000 U/min für 2 Minuten bei 30 °C durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen wurden die scheinbaren (U/gKatalysator), spezifischen (U/mgEnzym) und relativen (%) Aktivitäten geschätzt. Die zur Berechnung der Aktivität verwendeten Gleichungen sind in den ergänzenden Materialien angegeben. Kinetische Parameter, einschließlich der Michaelis-Menten-Konstante (KM) und der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax), wurden mithilfe eines enzymatischen Assays bestimmt, der auf derselben oben genannten Reaktion basiert und verschiedene Konzentrationen der Substratlösung (0,005–1,5 M) verwendet. Die scheinbaren kinetischen Parameter des freien und immobilisierten Enzyms wurden basierend auf dem Hanes-Woolf-Diagramm berechnet. Die Immobilisierungseffizienz wurde auch indirekt durch FTIR- und XPS-Analyse bestätigt.

Die Morphologie der MxOy/Fuc-Hybride und der immobilisierten Lipase wurde auf der Grundlage von Fotografien der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) (LSM710, Zeiss, Deutschland) bewertet, die mit einem Argonlaser (488 nm) aufgenommen wurden. Im Materialmodus (reflektiertes Licht) arbeitete der Laser bei einer Wellenlänge von 458 nm. Im Fluoreszenzmodus arbeitete der Laser bei 488 nm und Fluoreszenz wurde im Bereich 510–797 nm beobachtet.

Die spektroskopische Analyse wird zur Erforschung hybrider Materialien eingesetzt und liefert praktische Informationen wie Elementtyp, chemische Zusammensetzung, optische und elektronische Eigenschaften und Kristallinität. In dieser Studie wurden spektroskopische Analysen verwendet, um die Funktionalisierung von ZrO2 und MgO mit Fucoidan zu bestätigen. Die charakteristischen Gruppen in der Fucoidan-Struktur wurden anhand des FTIR-Spektrums genau interpretiert (Abb. 1). Die folgenden Banden wurden identifiziert: OH-Gruppe des Monosaccharidmonomers (bei 3500 cm−1); aliphatisches C–H (bei 2983 und 2945 cm−1); O-C-O-Streckschwingungen (bei 1635 cm−1); asymmetrische Streckschwingungen von S=O in der Sulfatgruppe (bei 1258 cm−1); Etherbindung C–O (bei 1070 cm−1); C–O–S (bei 846 cm–1); und eine charakteristische Bande für Desoxyzucker wie Fucose (bei 572 cm−1). Darüber hinaus entspricht ein Signal bei 846 cm−1 einer Sulfatierung in äquatorialer Position, wo der Sulfatester an das C-2 von Fucose bindet und Sulfatfucose bildet54,55.

FTIR-Spektren von Fucoidan, MgO/Fuc und ZrO2/Fuc.

Die FTIR-Spektren von mit Fucoidan modifiziertem MgO und ZrO2 sind in Abb. 1 dargestellt. Sie bestätigen, dass das Metalloxid erfolgreich mit Fucoidan funktionalisiert wurde. Die charakteristischen Gruppen reines Oxid (Abb. 1S) und Fucoidan erscheinen in den FTIR-Spektren von MgO/Fuc und ZrO2/Fuc. Im FTIR-Spektrum von MgO/Fuc (Abb. 1) sind die folgenden Fucoidangruppen vorhanden: OH (bei 3450 cm−1); C=O (bei 1650 cm−1); S=O (bei 1450 cm−1); C–O (bei 1150 cm−1). Die kleine Bande für CO-Gruppen und die kleine und breite Bande für OH-Gruppen weisen auf die direkte Verbindung des Fucoidans mit der MgO-Oberfläche hin.

Das FTIR-Spektrum für ZrO2/Fuc enthält Banden für OH (bei 3450 cm−1); C–H (bei 2900 cm−1); S=O (1400 cm−1); und C–O–S (bei 800 cm−1) (Abb. 1). Die breite und intensive Bande mit einem Maximum bei 3500 cm−1 weist auf die Verbindung von Fucoidan mit ZrO2 über Wasserstoffbrückenbindungen von Wassermolekülen hin. Dies wird weiter durch die Verschiebung dieser Bande im Vergleich zu der für reines Fucoidan erhaltenen Bande belegt. Der schmale und schwache Peak bei 3700 cm-1 kann von reinem Wasser stammen, das sich während des Fucoidan-Funktionalisierungsprozesses in wässriger Lösung an die Fucoidan-modifizierte Oberfläche von ZrO2 anlagert.

XPS-Spektroskopie wurde auch verwendet, um die Funktionalisierung von MgO und ZrO2 mit Fucoidan zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Auf der Oberfläche von MgO und ZrO2 (Abb. 2S) sind Elemente wie Magnesium, Zirkonium und Sauerstoff vorhanden. Die MgO/Fuc- und ZrO2/Fuc-Hybride enthalten die gleichen Elemente, es sind jedoch auch Kohlenstoff und Schwefel vorhanden, was eine Folge der Modifikation mit Fucoidan ist (Abb. 2a).

XPS-Vermessungsspektren von MgO/Fuc und ZrO2/Fuc (a) und das entfaltete XPS von C 1s für MgO/Fuc; S 2p für MgO/Fuc; C 1s für ZrO2/Fuc; und S 2p für ZrO2/Fuc (b).

Zusätzliche Informationen zur Wechselwirkung von Fucoidan mit der Oberfläche des anorganischen Oxids liefert eine detaillierte Analyse der C 1s- und S 2p-Linien des XPS-Spektrums. Die XPS C 1s- und S 2p-Linien der MgO/Fuc- und ZrO2/Fuc-Hybride sind in Abb. 2b dargestellt. Auf der Oberfläche von MgO und ZrO2 sind keine Kohlenstoff- und Schwefelatome vorhanden (Abb. 2S). In der XPS-C1s-Linie für MgO/Fuc wurden die beiden C1s-Peaks bei etwa 288,7 eV und 286,2 eV identifiziert, was O-C-O- bzw. C-OH/C-O-Bindungen entspricht. Hier sind die C-OH/C-O-Bindungen stärker ausgedehnt. Eine andere Situation ist bei der C 1s-Linie für ZrO2/Fuc zu beobachten. In diesem Fall werden auch die beiden C 1s-Peaks bei etwa 290,8 eV (O–C–O) und 289,4 eV (C–OH/C–O) erkannt. Die Größe dieser Peaks ist jedoch ähnlich. Die Dekonvolution des Fucoidan S 2p-Spektralpeaks zeigt zwei chemische Schwefelumgebungen bei etwa 167,0 eV (für die –SO3–-Gruppe) und 170,9 eV (für die interagierende –OSO3–-Gruppe)56,57,58. Für MgO/Fuc und ZrO2/Fuc wurde nur eine Schwefelumgebung bei Bindungsenergien von 170,7 eV (wechselwirkende –OSO3–-Gruppe) bzw. 168,8 eV (–SO3–-Gruppe) beobachtet (Abb. 2b). Die Änderung des Bindungsenergiepeaks kann auf Wechselwirkungen einiger Fucoidansulfatgruppen mit der Oberfläche des Metalloxids hinweisen58.

Die 1H- und 13C-Spektren von reinem Fucoidan (Abb. 3) geben Aufschluss über die Struktur des reinen Polysaccharids und das charakteristische Wasserstoffbrückenbindungsmuster des verwendeten Materials und dienen als Referenz für die Analyse der gewonnenen Daten für die Untersuchung Proben. Da die Proben außerdem durch Nasssynthese gewonnen wurden, war zu erwarten, dass in den 1H-Spektren der funktionalisierten Matrizen ein Signal von restlichen Wassermolekülen zu finden ist. 13C-Spektren wurden verwendet, um zu bestätigen, dass Fucoidan-Moleküle in den Matrizen vorhanden waren. Unterschiede in den 13C-Spektren zwischen der reinen Fucoidan-Probe und der funktionalisierten Probe deuten auf eine Veränderung in der Struktur der Polysaccharidkette hin, die durch Wechselwirkung mit der Oberfläche der Matrix verursacht wird. Da Fucoidan-Moleküle Wasserstoffbrückenbindungen bilden können, würde die Änderung der 1H-Spektren auf einen Mechanismus der Funktionalisierung der Oberfläche der Matrizen mit Fucoidan-Molekülen hinweisen, der auf der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Oberfläche der Matrix und den Fucoidan-Molekülen beruht.

Festkörper-DP/MAS-SE-1H-NMR-Spektrum (a) und CP/MAS-13C-NMR-Spektrum (b) von Fucoidan bei Raumtemperatur. Festkörper-DP/MAS-1H-NMR-Spektren für MgO/Fuc (c) und ZrO2/Fuc (d) bei Raumtemperatur; und Festkörper-CP/MAS-13C-NMR-Spektren für MgO/Fuc (e) und ZrO2/Fuc (f) bei Raumtemperatur.

Das 1H-Spektrum (Abb. 3a) zeigt ein intensives Signal im Bereich von 5,5–4,25 ppm, das von an C2–C5-Kohlenstoffatomen gebundenen Ringprotonen, OH-Gruppen von Fucoidan und restlichen Wassermolekülen stammt. Kleine Signale bei 2–1,5 ppm stammen von Methylgruppen an C6-Kohlenstoffen. Das 13C-Spektrum (Abb. 3b) zeigt ein starkes Signal bei 16,8 ppm, das als C6-Kohlenstoff in Methylgruppen identifiziert wurde, während das breite Signal bei 85–60 ppm von C2–C5-Ringkohlenstoffen und das Signal bei 100 ppm von C1-Kohlenstoff stammt.

Abbildung 3c–f zeigt die 1H- und 13C-Spektren, die für mit Fucoidanmolekülen funktionalisierte Matrizen aufgezeichnet wurden. Im ZrO2/Fuc 1H-Spektrum ist ein starkes OH-Signal von Fucoidan und Restwasser zu beobachten (Abb. 3c). Die beobachtete Änderung der chemischen Verschiebung des intensivsten Signals im Bereich von 5,5–4,25 ppm hängt mit den OH-Gruppen in Fucoidan und Restwasser zusammen, was darauf hindeutet, dass sich die Struktur der in den Proben vorhandenen Wasserstoffbrückenbindungen verändert. Im Fall von ZrO2 (Abb. 3c) ist eine Aufspaltung des Signals im Bereich von 7,5 bis 3,5 ppm zu beobachten. Diese Aufspaltung wird durch OH-Gruppen verursacht, die an der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Fucoidanmolekülen und der Oberfläche der ZrO2-Matrix beteiligt sind. Der Peak verschiebt sich um 1,4 ppm in Richtung niedrigerer Felder, was auf die Entstehung starker Wasserstoffbrücken hinweist. Der zweite Peak, der bei 4,3 ppm erscheint, entspricht sehr gut Protonensignalen von der Ringeinheit des Fucoidan-Moleküls. Zusammen mit der fehlenden Änderung der Signalposition bei 2–1,5 ppm impliziert dies, dass die Mechanismen der Funktionalisierung der ZrO2-Matrix mit Fucoidan auf der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen beruhen. Die verwendete MgO-Matrix wurde kommerziell erworben und ohne weitere Vorbereitung für das Funktionalisierungsverfahren verwendet. Die Protonenspektren dieser mit Fucoidan funktionalisierten Matrix sind in Abb. 3e dargestellt. Es wurden nur kleine Signale von Fucoidan-Molekülen erkannt, kein Peak von restlichen Wassermolekülen. Die beobachteten chemischen Verschiebungen entsprechen denen der in der Literatur gefundenen Fucoidan-Moleküle, und es wurde keine Verschiebung des Hydroxylgruppensignals festgestellt.

Einen direkten Beweis für das Vorhandensein von Fucoidan-Molekülen in den untersuchten Matrizen liefern die 13C-Spektren. Die 13C-Spektren der untersuchten Proben sind in Abb. 3e,f dargestellt. Nur die mit Fucoidan funktionalisierte ZrO2-Matrix zeigt gut nachweisbare Signale der Fucoidan-Einheiten; Im Fall von MgO-Matrizen wurden nur sehr schwache Signale von aromatischen Kohlenstoffen detektiert. Durch den Vergleich der 1H- und 13C-Spektren der untersuchten Proben können wir Rückschlüsse auf die chemische Zusammensetzung der Proben ziehen. Die kommerziell erworbene MgO-Matrix erwies sich nach den Syntheseprozessen als frei von jeglichen Verunreinigungen, in der funktionalisierten Matrix wurden jedoch nur sehr geringe Mengen an Fucoidan-Molekülen gefunden. Die schwachen 1H-Signale der Fucoidan-Moleküle weisen auf eine sehr geringe Menge dieser Substanz hin, was auch durch die kaum nachweisbaren 13C-Signale der Fucose-Einheit bestätigt wird. Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass auch die Signale von Restwassermolekülen fehlen, die nach dem Funktionalisierungsprozess erwartet werden.

Auf Basis der spektroskopischen Analysen kann geschlossen werden, dass die Funktionalisierung von Oxidmaterialien mit Fucoidanmolekülen erfolgreich war. Die NMR-Analyse zeigt jedoch, dass für ZrO2 eine bessere Wirkung erzielt wurde. Es wurde gezeigt, dass Fucoidan-Moleküle über Wasserstoffbrückenbindungen an die Oberfläche der ZrO2-Matrix binden; Die Moleküle können direkt oder über Restwassermoleküle gebunden sein. Darüber hinaus wurden nach der Funktionalisierung von MgO nur sehr geringe Spuren an Fucoidan-Einheiten gefunden. Außerdem ist zu beachten, dass in dieser Probe kein Signal von den Hydroxylgruppen der Wassermoleküle nachgewiesen wurde. Daraus lässt sich schließen, dass Wasser eine wichtige Rolle im Funktionalisierungsprozess spielt und die Bindung von Fucoidanmolekülen an die Oberfläche der Matrix vermittelt. Darüber hinaus bestätigen FTIR- und XPS-Analysen die positive Modifikation mit Fucoidan, wobei die charakteristischen Bindungen/Picks für Fucoidan beobachtet werden.

Abbildung 4 zeigt die TG/DTG-Kurven von Fucoidan und den MgO/Fuc- und ZrO2/Fuc-Hybriden. Das Fucoidan-Thermogramm (Abb. 4a) zeigt vier Massenverlustschritte. Der erste Massenverlust (exothermer Peak I) von 6 % bei 100 °C entspricht physikalisch adsorbiertem Wasser. Die zweite und dritte Phase bei 240 °C (ca. 22 %, exothermer Peak II) und 355 °C (42 %, exothermer Peak III) sind mit dem Verlust von Sulfatgruppen verbunden. Der endgültige Massenverlust von ca. 70 %, der bei 800 °C auftritt (exothermer Peak IV), hängt wahrscheinlich mit der Zersetzung von Kohlenstoffrückständen zusammen48,59. Darüber hinaus werden Veränderungen zwischen den TG/DTG-Kurven von reinem anorganischem Oxid (Abb. 6S) und der Probe nach Fucoidan-Funktionalisierung (Abb. 4b, c) beobachtet. Die MgO/Fuc-Probe wies einen Gesamtmasseverlust von 5 % auf. Der Massenverlust erfolgte in drei Schritten, mit großen Verlusten im zweiten Schritt (ca. 4 % bei 380 °C) und im dritten (5 % bei 650 °C), die wahrscheinlich auf die kollektive Zersetzung der Oberflächenbeschichtung zurückzuführen sind Fucoidan-Polymereinheiten59. Eine Änderung des Gesamtmassenverlusts ist auch in den TG/DTG-Kurven von ZrO2 (Abb. 8S) und ZrO2/Fuc (Abb. 4c) zu beobachten. In diesem Fall verliert der ZrO2/Fuc-Hybrid etwa 20 % seiner Gesamtmasse. Hier werden nur zwei exotherme Peaks beobachtet (bei 100 und 220 °C), die mit physikalisch und chemisch adsorbiertem Wasser verbunden sind. Die Art des Massenverlusts und der fehlende Peak über 600 °C legen nahe, dass die Fucoidanmoleküle aus dem System verdampften, bevor es zur Zersetzung von Kohlenstoffrückständen kam. Dies lässt sich verstehen, wenn die Fucoidan-Moleküle über Wassermoleküle an die ZrO2-Oberfläche gebunden wären.

TG/DTG-Kurven von Fucoidan (a); MgO/Fuc (b); und ZrO2/Fuc (c).

Die Veränderungen im Gesamtmassenverlust beider Proben nach der Fucoidan-Modifikation (MgO/Fuc und ZrO2/Fuc) lassen jedoch darauf schließen, dass Fucoidan erfolgreich auf der Oberfläche von MgO und ZrO2 eingebaut wurde.

Die entworfenen MgO/Fuc- und ZrO2/Fuc-Hybridmaterialien wurden als Träger für die Lipase-Immobilisierung verwendet. Der Einfluss des pH-Werts auf die Lipase-Immobilisierung wurde wie in Abb. 5 dargestellt untersucht. Die Immobilisierungsausbeute an Lipase auf MgO/Fuc stieg von 65 % bei pH 4 auf den höchsten Wert von 88,4 % bei pH 7,0, sank jedoch auf 66,2 % bei pH 9 Die Immobilisierungsausbeute der Lipase auf ZrO2/Fuc zeigte eine ähnliche Tendenz: Sie betrug 34,8 % bei pH 4, erreichte den höchsten Wert von 78,2 % bei pH 8 und sank auf 45 % bei pH 9. Die Protonen binden an das freie Elektronenpaar Elektronen am Amino-N-Atom unter sauren Bedingungen. Unter pH-Wert 8 hingegen werden die Wasserstoffbrückenbindungen auf dem Träger unter alkalischen Bedingungen aufgebrochen4,5. Basierend auf den Informationen wurde der optimale pH-Wert für die Immobilisierung mit 7,0 ermittelt.

Einfluss des pH-Werts auf die Immobilisierung von Lipase aus Aspergillus niger auf MgO/Fuc und ZrO2/Fuc.

Grundlegende Informationen zur Effizienz der Enzymimmobilisierung und zur katalytischen Aktivität der auf MgO/Fuc und ZrO2/Fuc immobilisierten Lipase sind in Tabelle 1S aufgeführt. Die Ergebnisse der katalytischen Parameter deuten darauf hin, dass die in dieser Studie vorgeschlagenen Materialien (sowohl MgO/Fuc als auch ZrO2/Fuc) als Träger für das Enzym verwendet werden können. Die Menge der immobilisierten Lipase betrug 91,8 mg auf 1 g MgO/Fuc und 70,8 mg auf 1 g ZrO2/Fuc. Die Immobilisierungseffizienz betrug 61,2 % bzw. 78,6 %. Die erhaltenen biokatalytischen Systeme (MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN) zeigten ähnliche katalytische Aktivitäten. Auf MgO/Fuc immobilisierte Lipase hatte scheinbare und spezifische Aktivitäten von 145,5 U/g Katalysator und 1,58 U/mg Enzym, während die entsprechenden Werte für das biokatalytische System ZrO2/Fuc/LAN AAp = 144,0 U/g Katalysator und AS = 2,03 U/mg Enzym waren.

Der Einfluss von Temperatur und Wiederverwendung über mehrere Zyklen auf die enzymatische Aktivität der immobilisierten Lipase wurde bewertet (Abb. 6). Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl auf MgO/Fuc als auch auf ZrO2/Fuc immobilisierte Lipase bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 70 °C über 40 % ihrer Aktivität beibehielt (Abb. 6a). In beiden Fällen (MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN) wurde die maximale Aktivität bei 50 °C erreicht, was darauf hindeutet, dass auf den vorgeschlagenen Materialien immobilisierte Lipase unter härteren Bedingungen verwendet werden kann. Darüber hinaus weist das immobilisierte Enzym eine heterogene Form auf und kann über mehrere enzymatische Reaktionszyklen hinweg eingesetzt werden. Die Tests zeigten, dass die vorgeschlagenen biokatalytischen Systeme (MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN) ca. 40 % ihrer ursprünglichen Aktivität nach 12 Zyklen (Abb. 6b).

Einfluss von Temperatur (a) und wiederholter Anwendung auf die katalytische Aktivität freier und immobilisierter Lipase (b).

Zusätzlich wurden die kinetischen Parameter wie Michaelis-Menten-Konstante (KM) und maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein niedrigerer KM-Wert nach der Immobilisierung weist auf eine höhere Bindungsfähigkeit gegenüber dem Substrat hin. Der höhere Vmax lässt darauf schließen, dass die immobilisierte Lipase die Reaktion schneller katalysieren kann als freie Lipase.

Chitin, Chitosan und Cellulose sind die Polysaccharide, die am häufigsten zur Modifizierung anorganischer Oxide verwendet werden. Ein Vergleich der in dieser Studie erzielten Ergebnisse mit früheren Ergebnissen zur Lipaseimmobilisierung auf verschiedenen Hybriden auf Polysaccharidbasis ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Materialien auf Basis von Polysacchariden und anorganischen Oxiden erfolgreich als Träger für die Immobilisierung von Lipase eingesetzt werden können ( unterschiedlicher Herkunft). Verschiedene Arten von Lipasen (aus Candida rugosa, Schweinepankreas, Aspergillus niger und Rhizomucor miehei) wurden auf den folgenden Matrizen immobilisiert: Chitin/Graphenoxid, Chitosan/mesoporöses Siliciumdioxid, mit Chitosan beschichtete magnetische Nanopartikel und Cellulose/Fe2O360,61,62, 63. Die immobilisierten Lipasen zeigten eine enzymatische Aktivität im Bereich von 125–328 U/g und konnten über mehrere Reaktionszyklen (von 5 bis 14) verwendet werden, wobei 50–90 % ihrer ursprünglichen Aktivität beibehalten wurden. Die in der vorliegenden Studie erzielten Ergebnisse ähneln denen anderer; Der beobachtete Unterschied ist wahrscheinlich auf die Verwendung verschiedener Arten von Lipasen zurückzuführen, die in ihrer nativen Form unterschiedliche enzymatische Aktivitäten aufweisen.

Der Erfolg des Immobilisierungsprozesses wurde indirekt auch durch die Ergebnisse der FTIR- und XPS-Analyse bestätigt, die in Abb. 6 als Spektren dargestellt sind.

Basierend auf den FTIR-Spektren (Abb. 7a) wird der Schluss gezogen, dass die meisten der charakteristischen Gruppen für Lipase auch auf der Oberfläche des vorgeschlagenen biokatalytischen Systems beobachtet werden. Die folgenden Hauptsignale sind im FTIR-Spektrum der Lipase vorhanden: Streckschwingungen von N-H-Bindungen bei 3220 cm-1, Amid-I-, II- und III-Banden (von 1650 bis 1410 cm-1) und Streckung von C-O Bindungen bei 1080 cm−1. Die beobachteten Veränderungen zwischen den FTIR-Spektren des reinen Trägers (Abb. 1) und des Systems mit immobilisierter Lipase bestätigen den Erfolg des Immobilisierungsprozesses. Im FTIR-Spektrum von MgO/Fuc/LAN werden die größten Veränderungen in den Amid III- und –C–O-Banden beobachtet, während das ZrO2/Fuc/LAN-Spektrum Veränderungen in den N–H- und C–O-Banden aufweist.

FTIR-Spektren von Lipase, MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN (a). XPS-Übersichtsspektren (b) und Entfaltung der N 1s-Linie (c) für native Lipase, MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN.

Das XPS-Spektrum der freien Lipase (Abb. 7b) enthält drei charakteristische Peaks bei Bindungsenergien von 531,0 eV, 400,7 eV und 287,7 eV, die mit O 1s, N 1s und C 1s in Zusammenhang stehen. Die gleichen Peaks werden in den Untersuchungsspektren von MgO/Fuc/LAN und ZrO2/Fuc/LAN beobachtet, was das Vorhandensein von Lipase auf der Oberfläche des Hybridmaterials bestätigt. Am wichtigsten ist das Vorhandensein von N 1s-Peaks (Abb. 7c; auf dem reinen Träger nicht beobachtet – siehe Abb. 2), die den CO-NH- und Aminogruppen der Lipase zugeschrieben werden können und einen weiteren Beweis für die Immobilisierung liefern von Lipase auf dem mit Fucoidan funktionalisierten Oxid59. Darüber hinaus bestätigen Veränderungen in den C 1s-Entfaltungslinien auch die Immobilisierung der Lipase (siehe Abb. 5S).

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass MgO/Fuc und ZrO2/Fuc nach der Lipase-Immobilisierung eine erhöhte Fluoreszenzintensität aufwiesen, was indirekt das Vorhandensein von Enzymbiomolekülen in den Hybridmaterialien bestätigt (Abb. 8). Mikroskopische Bilder von MgO/Fuc und MgO/Fuc/LAN zeigen in beiden Modi eine homogene Struktur (Abb. 8a). Die Bilder von ZrO2/Fuc (Abb. 8b) zeigen eine geringe Anzahl heller Punkte, während das biokatalytische System ZrO2/Fuc/LAN mehr Licht emittiert.

Konfokale Mikroskopiebilder von MgO/Fuc und MgO/Fuc/LAN (a); ZrO2/Fuc und ZrO2/Fuc/LAN (b) im Reflexions- und Fluoreszenzmodus.

Zusammenfassend bestätigen die erzielten Ergebnisse, dass die Funktionalisierung von MxOy mit Fucoidan und die anschließende Immobilisierung der Lipase erfolgreich durchgeführt wurden. Basierend auf der spektroskopischen Analyse wurde ein Mechanismus der Wechselwirkung zwischen den Oxidmaterialien Fucoidan und dem Enzym vorgeschlagen (Abb. 9). Wie gezeigt, bindet Fucoidan direkt an die MgO-Oberfläche und es werden Wasserstoffbrückenbindungen gebildet, während die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Fucoidan und ZrO2 über Wassermoleküle erzeugt werden. Zwischen dem Träger und dem Enzym bestehen ausschließlich elektrostatische Wechselwirkungen.

Vorgeschlagener Mechanismus der Wechselwirkung zwischen dem Oxidträger: MgO (a) und ZrO2 (b), Fucoidan und Lipase.

In dieser Studie wurden neue Hybride auf Polysaccharidbasis hergestellt und zur Lipaseimmobilisierung eingesetzt. Die vorgeschlagenen Hybridmaterialien wurden durch Funktionalisierung von Magnesium- (MgO) und Zirkoniumoxiden (ZrO2) mit Fucoidan aus Fucus vesiculosus hergestellt. Physikalisch-chemische Analysen bestätigten die wirksame Modifikation von Magnesiumoxid und Zirkonoxid mit Fucoidan aus Fucus vesiculosus. Tests der katalytischen Eigenschaften zeigten, dass die hergestellten MxOy/Hybride als Träger für die Immobilisierung von Lipase aus Aspergillus niger verwendet werden können. Es wurde eine erhöhte enzymatische Aktivität (ca. 145 U/g) erreicht und die erhaltenen biokatalytischen Systeme können über mehrere enzymatische Zyklen hinweg verwendet werden, wobei ein hoher Prozentsatz ihrer ursprünglichen Aktivität erhalten bleibt. Die kinetischen Parameter zeigen, dass die immobilisierte Lipase die enzymatische Reaktion schneller katalysieren kann als ihre freie Form. Die in diesen Experimenten erzielten Ergebnisse zeigen, dass Hybride auf Basis von Fucoidan und anorganischem Oxid erfolgreich bei der Enzymimmobilisierung eingesetzt werden können.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24515-9

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Konzeptualisierung; Datenkuration; formale Analyse; Methodik; Rollen/Schreiben – Originalentwurf – AK-R.; Formale Analyse; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten – MB; Formale Analyse – AB, Supervision; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten – TJ Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Agnieszka Kołodziejczak-Radzimska.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kołodziejczak-Radzimska, A., Bielejewski, M., Biadasz, A. et al. Bewertung des MxOy/Fucoidan-Hybridsystems und seiner Anwendung im Lipase-Immobilisierungsprozess. Sci Rep 12, 7218 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11319-0

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Eingegangen: 21. Februar 2022

Angenommen: 21. April 2022

Veröffentlicht: 04. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11319-0

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