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Jun 21, 2023

Das Vertex-Protein PduN optimiert die Leistung des verkapselten Signalwegs, indem es die Morphologie der bakteriellen Metabolosomen bestimmt

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3746 (2022) Diesen Artikel zitieren 2584 Zugriffe 5 Zitate 9 Details zu altmetrischen Metriken Die Entwicklung der subzellulären Organisation in Mikroben zeigt großartige Ergebnisse

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3746 (2022) Diesen Artikel zitieren

2584 Zugriffe

5 Zitate

9 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Manipulation der subzellulären Organisation in Mikroben ist vielversprechend bei der Beseitigung von Engpässen bei metabolischen Engineering-Bemühungen. Es fehlen jedoch Regeln für die Auswahl einer Organisationsstrategie oder -plattform. Hier untersuchen wir die Kompartimentmorphologie als einen Faktor bei der Vermittlung der Leistung gekapselter Signalwege. Unter Verwendung des 1,2-Propandiol-Verwertungs-Mikrokompartimentsystems (Pdu MCP) des Salmonella enterica-Serovars Typhimurium LT2 stellen wir fest, dass wir die Morphologie dieses Protein-Nanoreaktors von polyedrisch zu röhrenförmig verschieben können, indem wir das Vertex-Protein PduN entfernen. Die Analyse der Stoffwechselfunktion zwischen diesen Pdu-Mikroröhren (MTs) zeigt, dass sie eine Diffusionsbarriere darstellen, die das Zytosol vor einem Zwischenprodukt des toxischen Signalwegs schützen kann, ähnlich wie native MCPs. Kinetische Modellierungen legen jedoch nahe, dass die unterschiedlichen Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen von MCP- und MT-Strukturen die Leistung des eingekapselten Signalwegs verändern. Abschließend berichten wir über einen mikroskopiebasierten Assay, der eine schnelle Beurteilung der Pdu-MT-Bildung ermöglicht, um zukünftige technische Arbeiten an diesen Strukturen zu ermöglichen.

Die räumliche Organisation biologischer Prozesse ist für das Leben vieler Organismen, von mehrzelligen Eukaryoten bis hin zu einzelligen Prokaryoten, von wesentlicher Bedeutung. Früher wurde angenommen, dass es Bakterien an subzellulärer Organisation mangelt, und sie nutzen eine Reihe von Strategien, um bestimmte Prozesse innerhalb der Zelle zu trennen. Ein solches Beispiel sind bakterielle Mikrokompartimente (MCPs), bei denen es sich um Organellen handelt, die bestimmte Enzymsätze in einer Proteinhülle umschließen1,2. Mit MCPs assoziierte Gene kommen in 45 Bakterienstämmen vor3,4 und werden nach den von ihnen verkapselten Stoffwechselwegsegmenten klassifiziert. Auf der höchsten Ebene werden MCPs entweder als Carboxysomen oder Metabolosomen klassifiziert, je nachdem, ob sie Pfade umhüllen, die an anabolen bzw. katabolen Prozessen beteiligt sind1. Carboxysomen helfen vielen kohlenstofffixierenden Bakterien, indem sie die CO2-Konzentration in der Nähe des carboxylierenden Enzyms Ribulosebisphosphatcarboxylase/Oxygenase (RuBisCO)5,6 erhöhen. Metabolosomen hingegen unterstützen den Metabolismus einer breiten Palette von Substraten und verkapseln so viele verschiedene Stoffwechselwege. Allerdings haben diese Wege typischerweise das gemeinsame Merkmal, dass sie über ein toxisches Aldehyd-Zwischenprodukt verlaufen7,8. Es wird angenommen, dass die Sequestrierung dieses toxischen Zwischenprodukts den Metabolismus von Nischenkohlenstoffquellen wie 1,2-Propandiol und Ethanolamin unterstützt und den Darmpathogenen, die häufig Metabolosomen beherbergen, einen Wettbewerbsvorteil beim Wachstum verschafft9,10.

MCPs stellen attraktive technische Ziele in einer Vielzahl von Anwendungen dar, von der Bioproduktion, bei der die Einkapselung heterologer Enzyme die Signalwegleistung verbessern könnte11, bis hin zur Antibiotikaentwicklung, bei der die Zerstörung dieser MCP-Strukturen einen Wettbewerbswachstumsvorteil zunichte machen könnte9. Insbesondere Metabolosomen weisen jedoch eine Vielfalt in Form und Größe auf, und es ist nicht genau geklärt, wie diese Merkmale mit der Funktion zusammenhängen4,12,13,14,15. Verschiedene technische Bereiche, von der Katalyse16 bis zur Arzneimittelabgabe17, haben die Bedeutung von Form und Größe für die Leistung von Nanomaterialien veranschaulicht. Die Relevanz dieser Merkmale muss in MCP-Systemen noch sinnvoll untersucht werden.

Das 1,2-Propandiol-Verwertungs-MCP (Pdu) ist ein Modellmetabolosom, das den Abbau von 1,2-Propandiol unterstützt18. Pdu-MCPs kommen in einer Vielzahl von Bakterien vor3,4,10 und sowohl der eingekapselte Weg10,18,19 als auch die Struktur20 dieser Metabolosomen wurden untersucht. Das pdu-Operon enthält 21 Gene, die für die Proteine ​​kodieren, aus denen die Pdu-MCP-Hülle besteht, sowie für den Hauptweg und die Cofaktor-Recycling-Enzyme (Abb. 1). Acht Proteine ​​bilden die Hülle des Pdu-Mikrokompartiments (MCP): PduA, PduB, PduB', PduJ, PduK, PduN, PduT und PduU21,22. Von diesen acht Proteinen enthalten sieben (PduABB'JKTU) eine oder mehrere pfam00936-Domänen des bakteriellen Mikrokompartiments (BMC) und bilden als solche die hexagonalen Multimere, die sich zu den Facetten und Kanten des Mikrokompartiments zusammenfügen22,23,24,25,26 ,27. pduN ist das einzige pfam03319-Gen des bakteriellen Mikrokompartiment-Vertex (BMV) im pdu-Operon und dürfte daher Pentamere bilden, die die Eckpunkte des Pdu MCP15,28,29,30,31,32 bedecken. PduN ist ein Bestandteil der MCP-Schale mit geringer Häufigkeit, ist jedoch für die Bildung wohlgeformter Kompartimentstrukturen unerlässlich21,22,33. Während frühere Studien gezeigt haben, dass sich in Abwesenheit von PduN abweichende Strukturen bilden, müssen Funktionalität und Natur dieser Strukturen noch im Detail untersucht werden. Darüber hinaus zeigten Studien sowohl an Alpha- als auch an Beta-Carboxysomen, dass ein strikter Verschluss der Schale erforderlich ist, damit diese Mikrokompartimente ihre biologisch relevanten Wachstumsvorteile entfalten können, und dass dies ohne pentamere Vertex-Schalenproteine ​​wie PduN nicht erreicht werden kann34,35. Es ist unklar, wie wichtig dieser strikte Verschluss für Metabolosomensysteme wie das Pdu-MCP ist, da Modellstudien gezeigt haben, dass eine moderate Diffusionsbarriere zwischen dem Zytosol und einem Enzymkern ausreicht, um den Aufbau toxischer Zwischenprodukte zu vermitteln36. Frühere Arbeiten haben auf die unterschiedliche Bedeutung verschiedener Schalenproteine, einschließlich PduN, für die Pdu-MCP-Funktion hingewiesen22; Es bleiben jedoch Fragen offen, wie genau die MCP-Morphologie die Leistung des Pdu-Signalwegs steuert.

Das pdu-Operon im Salmonella enterica-Serovar Typhimurium LT2 enthält die Gene, die für Proteine ​​kodieren, die für die Bildung des 1,2-Propandiol-Verwertungsmikrokompartiments (Pdu MCP) verantwortlich sind. Dazu gehören Enzyme, die sowohl wichtige Stoffwechselschritte als auch Cofaktor-Recyclingfunktionen ausführen (orange), und Schalenproteine, die diese Enzyme umhüllen (bakterielles Mikrokompartiment, BMC, domänenhaltige Gene blau dargestellt, bakterieller Mikrokompartiment-Scheitelpunkt BMV, domänenhaltiges Gen grün dargestellt). ). Bemerkenswert ist, dass nur ein Shell-Protein im pdu-Operon, PduN, eine BMV-Domäne enthält.

Hier beschreiben wir unsere detaillierte Charakterisierung einer MCP-bezogenen Struktur, die wir Pdu-Mikroröhren (Pdu MTs) nennen und die sich bilden, wenn das Vertex-Protein PduN nicht in die Pdu-MCP-Hülle eingebaut werden kann, und verwenden molekulardynamische Modelle, um die molekularen Wechselwirkungen zu verstehen, die für diese Morphologie verantwortlich sind Schicht. Wir untersuchen, wie sich diese Verschiebung der Morphologie auf die Leistung des verkapselten Signalwegs auswirkt, und verwenden kinetische Modellierung, um zu untersuchen, welche Merkmale der Kompartimentgeometrie die Bildung toxischer Zwischenprodukte in der Zelle steuern. Abschließend präsentieren wir einen mikroskopiebasierten Assay, der die Bildung dieser Pdu-MTs untersucht und so die Untersuchung der wichtigsten molekularen Merkmale ermöglicht, die den PduN-Einbau in das Pdu-MCP steuern. Zusammengenommen stellen diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt zum Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen Schalenproteininteraktionen, Kompartimentmorphologie und der Leistung des eingekapselten Signalwegs dar.

Wir untersuchten zunächst den Einfluss von PduN auf die In-vivo-Assemblierung von Pdu-MCPs mithilfe einer Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) an dünnen Zellschnitten sowohl von Wildtyp- (WT, PduN-enthaltend) als auch von pduN-Knockout-Stämmen (ΔPduN). Unser Fluoreszenzmikroskopie-Assay verwendet einen Reporter für grün fluoreszierendes Protein (GFP), der mit einem Einkapselungspeptid fusioniert ist, das hier als ssD für die Signalsequenz von PduD bezeichnet wird und für die Einkapselung heterologer Proteine ​​in Pdu-MCPs ausreicht37. Somit wird die Kompartimentverteilung in der gesamten Zelle durch das Vorhandensein der grünen Fluoreszenz angezeigt, die mit dem im MCP-Lumen eingekapselten ssD-GFP-Reporter verbunden ist. Wie in früheren Studien führt die Expression von Pdu-MCPs im Wildtyp-Hintergrund (PduN-enthaltend) zu punktueller Fluoreszenz in der gesamten Zelle (Abb. 2c), was darauf hindeutet, dass gut ausgebildete Kompartimente innerhalb der Zelle verteilt sind 38, 39, 40. Wenn dagegen das pduN-Gen ausgeschaltet wird, führt die Expression des pdu-Operons zu Fluoreszenzlinien, die typischerweise an der Längsachse der Zelle ausgerichtet sind (Abb. 2c). Diese Fluoreszenzlinien weisen auf die Bildung länglicher Strukturen innerhalb der Zelle hin, die in der Lage sind, ssD-markiertes GFP zu rekrutieren. Tatsächlich bestätigt die Dünnschnitt-TEM von Zellen, die das pdu-Operon im pduN-Knockout-Stamm exprimieren, das Vorhandensein von Röhrenstrukturen, die im Folgenden als Pdu-MTs bezeichnet werden (Abb. 2c). Interessanterweise zeigen sowohl Fluoreszenzmikroskopie als auch Dünnschnitt-TEM, dass diese Pdu-MTs die Zellteilung zu hemmen scheinen, da die Strukturen mehrere Spaltungsfurchen durchlaufen (Abb. 2c, ergänzende Abb. 1). Obwohl es auffällt, sind solche verlängerten Strukturen in der MCP-Literatur nicht beispiellos – ähnliche verlängerte Strukturen wurden beispielsweise auch in Zellen beobachtet, die Pentamer-defiziente Carboxysomen exprimieren34. Über die Struktur oder den Proteingehalt dieser Röhrenstrukturen ist jedoch wenig bekannt.

a Darstellung verschiedener in dieser Abbildung verwendeter PDU-Operon-Genotypen. b Coomassie-gefärbte SDS-PAGE von gereinigten Pdu-MTs (ΔPduN) und Pdu-MCPs (WT) zum Vergleich des Proteingehalts in diesen gereinigten Strukturen, wobei die Markierungen das Pdu-Protein angeben, dem die Bande entspricht (d. h. C/G für PduC/PduG), außer Lys, was auf Lysozym hinweist. c Vergleich der Strukturen, die in Pdu MCP-bildenden Stämmen (WT) und Pdu MT-bildenden Stämmen (ΔPduN) gebildet werden. Maßstabsbalken in optischen und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen betragen 5 µm. d Phasenkontrast- und GFP-Fluoreszenzmikroskopaufnahmen, die den Einfluss einer erhöhten PduN-FLAG-Expression auf die Bildung von Pdu-MT-Strukturen im Vergleich zu geschlossenen Pdu-MCP-Strukturen zeigen, bei denen eine zunehmende Arabinosekonzentration mit einer zunehmenden Expression des PduN-FLAG-Proteins außerhalb des pBAD33-Plasmids korreliert. Maßstabsbalken in optischen und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen betragen 5 µm. e Coomassie-gefärbte SDS-PAGE, Anti-FLAG-Western-Blot und negativ gefärbtes TEM auf Pdu-MCPs, gereinigt aus einem pduN-Knockout-Stamm, ergänzt mit PduN-FLAG von einem Plasmid. Die Quelldaten für (b) und (e) werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Ähnliche Ergebnisse wie in (b–e) wurden bei drei unabhängigen biologischen Replikaten beobachtet, mit Ausnahme der TEM-Bildgebung dünner Zellschnitte, die an mehreren Zellen in einer bestimmten biologischen Probe durchgeführt wurde, jedoch nicht bei biologischen Replikaten.

Wir haben daher versucht, die Struktur der Pdu-MTs, die durch Expression des pdu-Operons in unserem pduN-Knockout-Stamm gebildet werden, im Detail zu untersuchen. Diese Pdu-MTs bestehen aus vielen der gleichen Schalenproteine ​​wie Pdu-MCPs, was durch das Vorhandensein von PduA-, PduB-, PduB'-, PduJ- und PduU-Banden durch SDS-PAGE in beiden Proben belegt wird (Abb. 2b). Bemerkenswerterweise sind in der gereinigten Pdu-MT-Probe auch Banden vorhanden, die mit enzymatischer Ladung (PduCDE, PduG, PduP, PduQ, PduS) assoziiert sind. Die TEM-Analyse gereinigter Pdu-MTs (Abb. 2c, ergänzende Abb. 2) zeigt, dass diese Röhren einen Durchmesser von 50 ± 10 nm haben, was mit den in Zellschnitten beobachteten Durchmessern übereinstimmt. Diese Dimension unterscheidet sich vom 20-nm-Durchmesser von Stäben, die sich allein aus PduA- und PduJ-Schalenproteinen selbst zusammensetzen,23,41, was darauf hindeutet, dass eine Kombination der anderen vorhandenen Schalenproteine ​​und der eingekapselten Ladung die Größe und Krümmung dieser Pdu-MTs bestimmt41,42. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die von unserem pduN-Knockout-Stamm gebildeten Pdu-MTs komplexe Multiprotein-Anordnungen sind, ähnlich den Pdu-MCPs.

Aufgrund der Beobachtung, dass das Ausschalten von pduN zur Bildung von Pdu-MTs anstelle von Pdu-MCPs führte, stellten wir die Hypothese auf, dass PduN direkt für die Vermittlung der Morphologie von Pdu-Mikrokompartimenten verantwortlich ist. Um diese Hypothese zu testen, ergänzten wir unseren pduN-Knockout-Stamm mit einem Plasmid, das FLAG-markiertes PduN enthielt, und beobachteten mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie Veränderungen in der Kompartimentmorphologie bei unterschiedlichen Induktorkonzentrationen (Abb. 2d). Wir stellen fest, dass eine zunehmende PduN-FLAG-Expression die Bildung länglicher Strukturen (Pdu MTs) verringert und die Beobachtung punktförmiger Fluoreszenz (Pdu MCPs) erhöht (Abb. 2d). Interessanterweise ist auch ohne Vorhandensein eines Induktors (0 Gew.-% Arabinose) ein Rückgang des Prozentsatzes der Zellen mit länglichen Strukturen zu beobachten (ergänzende Abbildung 3). Dies ist wahrscheinlich auf einen undichten PduN-FLAG-Ausdruck zurückzuführen. Da PduN nur 0,6 % des gesamten Schalenproteingehalts ausmacht, ist es nicht verwunderlich, dass selbst sehr geringe Mengen an PduN den Schalenschluss beeinflussen würden43. Wir validierten diese Mikroskopieergebnisse, indem wir Kompartimente aus einem pduN-Knockout-Stamm, ergänzt mit PduN-FLAG von einem Plasmid (0,02 Gew.-% Arabinose), reinigten. Diese Kompartimente weisen die charakteristische polyedrische Geometrie von Pdu-MCPs durch TEM und das charakteristische Streifenmuster wohlgeformter Pdu-MCPs durch SDS-PAGE auf (Abb. 2e). Darüber hinaus bestätigte ein Anti-FLAG-Western-Blot auf denselben gereinigten Kompartimenten das Vorhandensein von PduN-FLAG in diesen wohlgeformten Strukturen (Abb. 2e). Wir kommen zu dem Schluss, dass PduN eine direkte Rolle bei der Bildung von Pdu-MCPs spielt, wahrscheinlich durch die Erleichterung der Abdeckung von MCP-Scheitelpunkten.

Als nächstes untersuchten wir die molekularen Grundlagen, wie PduN den MCP-Schließung erleichtert, indem wir die Interaktionsschnittstelle, die für den PduN-Einbau verantwortlich ist, mithilfe von All-Atom-Molecular-Dynamics-Simulationen (AAMD) untersuchten. Frühere Arbeiten zur Modellierung der Grenzfläche zwischen zwei PduA-Hexameren zeigten, dass bevorzugte Wechselwirkungswinkel zwischen Hexameren eine Schlüsselrolle beim Aufbau dieser Proteine ​​höherer Ordnung spielen. Wir stellten die Hypothese auf, dass ähnliche Studien, in denen die PduN-Interaktionsschnittstelle mit der PduA/PduA-Schnittstelle verglichen wird, Einblicke in die spezifischen, einzigartigen Merkmale liefern könnten, die es PduN ermöglichen, das Pdu-MCP-Vertex-Capping zu initiieren. Wir haben PduA als Interaktionspartner für PduN ausgewählt, basierend auf früheren Studien, die zeigten, dass PduA und PduN ex vivo interagieren21. Wir haben ein geschätztes Modell der PduA/PduN- und PduA/PduA-Schnittstellen mithilfe eines homologiebasierten Ansatzes erstellt, der die gelöste Kristallstruktur des HO MCP (PDB: 5V74) nutzte. Diese Struktur liefert hervorragende molekulare Details darüber, wie sich homologe Schalenproteine ​​zu einer MCP-Schale zusammensetzen (Einzelheiten finden Sie unter „Methoden“)15,42. Mit diesem Modell als Ausgangspunkt führten wir AAMD-Simulationen dieser Schnittstelle durch, um die Energetik zu untersuchen, die mit verschiedenen Biegewinkeln zwischen PduA und PduN sowie zwischen PduA und PduA verbunden ist (Abb. 3). Insbesondere haben wir das Potenzial der mittleren Kraft (PMF) zwischen jedem Paar von Proteinoligomeren als Funktion des Biegewinkels zwischen den beiden Komponenten (Abb. 3b, e) und des Abstands zwischen ihren Massenschwerpunkten in y-Richtung berechnet ( Abb. 3c). Weitere Einzelheiten zur Berechnung finden Sie im Abschnitt „Methoden“ und „Ergänzende Methoden“. Die resultierende PduA/PduN-Biegeenergielandschaft zeigte eine starke Präferenz für einen 40°-Biegewinkel zwischen PduA und PduN (Abb. 3b), wobei die Biegeenergie (ΔG0°→40° = −6 ± 2 kcal/mol) mehr als die Hälfte ausmachte die gesamte Wechselwirkungsstärke (ΔGPduN/PduA = −10 ± 2 kcal/mol, Abb. 3c). Dies ist insbesondere größer als die Biegewinkel (30°) zwischen Hexamer-/Pentamer-Komponenten, die in der Kristallstruktur einer MCP-Schale aus Haliangium ochraceum15 berichtet werden. Diese Präferenz für eine gebogene Wechselwirkung unterscheidet sich von der Biegeenergielandschaft der PduA/PduA-Grenzfläche, die nur flache Minima (ΔG0°→34° = −1,2 ± 0,3 kcal/mol) aufweist, die weniger als ein Viertel des gesamten PduA ausmachen /PduA-Wechselwirkungsenergie (ΔGPduA/PduA = −11 ± 2 kcal/mol44) Wir bemerken zwei Dinge über diese Biegeenergielandschaft. Erstens, dass das Energieminimum bei 34° mit früheren Modellen übereinstimmt, die PduA/PduA-Biegewechselwirkungen untersuchten41. Zweitens stellen wir fest, dass ein zweites Minimum bei einem PduA/PduA-Wechselwirkungswinkel von ~70° existiert; Da dieser Biegewinkel jedoch den Zusammenbau größerer Ikosaeder oder Polyeder, wie sie im Pdu-MCP-System entstehen, nicht ermöglichen würde, glauben wir nicht, dass er für die Diskussion hier physikalisch relevant ist. Interessanterweise ist die Stärke der PduA/PduN- und PduA/PduA-Wechselwirkung ähnlich, obwohl sich die Biegewinkelpräferenz zwischen diesen beiden Grenzflächen dramatisch unterscheidet (Abb. 3c). Zusammengenommen lässt dies darauf schließen, dass PduN einen energetisch günstigen Biegepunkt bereitstellen könnte, der das Schließen der Schale ermöglicht, ohne dass eine ungünstigere Biegung der PduA/PduA-Grenzfläche erforderlich ist. Da diese Biegung der PduA/PduN-Wechselwirkung innewohnt, wären auch Dimere, Trimere oder andere PduN-markierende Oligomere ebenfalls stark gebogen. Daher würde ihr Einbau die Bildung kleinerer Pdu-MTs oder flacher Bleche, die aufgrund der geringen PduN-Konzentration wahrscheinlich zu Beginn des Montageprozesses vorhanden sind, schnell unterbrechen.

ein Schema der für diese Simulationen verwendeten PduA-PduN-Schnittstelle, wobei PduA in Blau und PduN in Grün dargestellt ist. b Potenzial der mittleren Kraft (PMF), berechnet aus AAMD-Simulationen als Funktion des Biegewinkels ΘB zwischen PduA und PduN. ΔG0°→40° ist der Unterschied im PMF zwischen den Biegewinkeln 0° und 40°. c PMF berechnet aus AAMD-Simulationen als Funktion des Abstands zwischen PduA und PduN und wird zur Berechnung der gesamten Wechselwirkungsenergie (ΔG) zwischen diesen beiden Oligomeren verwendet. d Schematische Darstellung der für diese Simulationen verwendeten PduA-PduA-Schnittstelle. e PMF berechnet aus AAMD-Simulationen als Funktion des Biegewinkels ΘB zwischen zwei PduA-Hexameren. ΔG0°→34° ist der Unterschied im PMF zwischen den Biegewinkeln 0° und 34°. Die verwendeten Berechnungen zur Berechnung der Datenpunkte in (b), (c) und (e) werden in der ergänzenden Methode 1 beschrieben. Fehlerbalken in den Diagrammen in (b), (c) und (e) stellen den Stichprobenfehler der berechneten Energien dar , geschätzt durch Aufteilen der Simulationsdaten in verschiedene Abschnitte und Beobachten der Unterschiede im berechneten Potenzial, wie in der ergänzenden Methode 1, Berechnungsspezifikationen, beschrieben. Quelldaten für Diagramme (b), (c) und (e) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Nachdem wir gezeigt hatten, dass sich in Abwesenheit von PduN verlängerte Pdu-MTs bilden, wollten wir als Nächstes die metabolische Funktionalität dieser Röhren untersuchen und untersuchen, wie sich die Organisation in MTs im Vergleich zu MCPs auf die Signalwegleistung auswirkt. Wir stellten die Hypothese auf, dass sich die morphologische Verschiebung von Pdu-MCPs zu MTs negativ auf die Signalwegleistung auswirken könnte, da wir davon ausgehen, dass die Pdu-MTs offene Enden haben, die den Austausch zwischen dem enzymatischen Kern und dem Zytosol erhöhen würden.

Wir untersuchten den Einfluss der Kompartimentgeometrie auf die Leistung des Pdu-Signalwegs, indem wir das Wachstum und die externen Pdu-Metabolitenprofile (1,2-Propandiol, Propionaldehyd, 1-Propanol und Propionat, Abb. 4a) von vier Stämmen – Wildtyp (MCP-bildend) – verglichen ), ΔPduN (MT-bildend), ΔPduA PduJ (gebrochene Kompartimentkontrolle23) und ΔPocR (keine pdu-Operon-Expressionskontrolle45,46,47). Wir haben diese Stämme auf 1,2-Propandiol mit überschüssigem Adenosylcobalamin (adoB12) gezüchtet, eine Bedingung, die die Unterscheidung von kompartimentbildenden Bedingungen ermöglicht, die das toxische Propionaldehyd-Zwischenprodukt erfolgreich vom Zytosol fernhalten22,48,49. Zellwachstums- und Metabolitenprofile (Abb. 4b, c) zeigen, dass die Kontrollstämme ΔPocR und ΔPduA PduJ wie erwartet wachsen. Wenn keine Expression des pdu-Operons (ΔPocR) erfolgt, findet im Laufe der Zeit kein Zellwachstum statt, da keines der Enzyme vorhanden ist, die zum 1,2-Propandiol-Metabolismus fähig sind (Abb. 4b). Die Metabolitenverfolgung bestätigt, dass kein 1,2-Propandiol verbraucht wird (Abb. 4c). Wenn das Operon exprimiert wird, sich Kompartimente jedoch nicht richtig bilden können (ΔPduA PduJ), erfolgen Zellwachstum und 1,2-Propandiol-Verbrauch zunächst schnell (Abb. 4b, c; Verdopplungszeit von 2,338 ± 0,003 h zwischen 3 und 9 h), wie Es gibt keine Hüllproteinbarriere, die den Enzymen den Zugang zu 1,2-Propandiol verhindert. Folglich weist dieser Stamm die schnellste anfängliche Bildung von Propionaldehyd, Propionat und 1-Propanol auf (Abb. 4c). Nach ca. 12 Stunden beginnt jedoch eine Wachstumsverzögerung aufzutreten, da die Propionaldehydansammlung einen Schwellenwert überschreitet (Verdoppelungszeit von 62 ± 18 Stunden zwischen 12 und 18 Stunden). Dadurch wird die Propionataufnahme in den Zentralstoffwechsel blockiert, was sowohl die beobachtete Wachstumsverzögerung als auch den verzögerten Propionatverbrauch bei diesem Stamm zwischen 12 und 30 Stunden erklärt (Abb. 4b). Mehrere Gruppen haben dies bei Stämmen mit einem gebrochenen Kompartiment-Phänotyp berichtet19,22,23,49, wobei die Hypothese aufgestellt wurde, dass Propionaldehyd den Methylcitrat-Weg hemmt50.

ein Schema des 1,2-Propandiol-Verwertungswegs, eingekapselt in Pdu-Mikrokompartimenten. b Stämme mit unterschiedlichen Kompartimentgeometrien (MCPs im Wildtyp, blaue Linien, MTs in ΔPduN, grüne Linien), ohne Kompartimentexpression (ΔPocR, graue Linien) und mit unterbrochenen Kompartimenten (ΔPduA PduJ, rote Linien), gezüchtet in Minimalmedien (NCE ) mit 1,2-Propandiol als einziger Kohlenstoffquelle. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung über drei biologische Replikate dargestellt. c Konzentration der wichtigsten Metaboliten des Stoffwechselwegs im Verlauf des in (b) beschriebenen Wachstums. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung über drei biologische Replikate dargestellt. Die Quelldaten für die Panels (b) und (c) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Im Gegensatz dazu weisen Stämme, die Pdu-MCPs (Wildtyp) und Pdu-MTs (ΔPduN) enthalten, Wachstumsprofile auf, die mit einem gut verkapselten Pdu-Signalweg übereinstimmen22. Das anfängliche Wachstum und der 1,2-Propandiol-Verbrauch sind etwas langsamer als bei der Kontrolle mit gebrochenem Kompartiment (ΔPduA PduJ), was Verdopplungszeiten von 3,17 ± 0,08 Stunden bzw. 2,64 ± 0,13 für Wildtyp- und ΔPduN-Stämme zwischen 3 und 9 Stunden entspricht. Allerdings übersteigt das Wachstum der WT- und ΔPduN-Stämme schließlich zu späteren Zeitpunkten den ΔPduA-PduJ-Stamm, da die Propionaldehydbildung beginnt, das Wachstum zu beeinflussen, was durch Verdopplungszeiten von 9,2 ± 1,6 Stunden für den WT-Stamm und 9,2 ± 1,9 Stunden für den ΔPduN-Stamm zwischen 12 und 12 belegt wird und 18 Uhr. Stämme, die Pdu MCPs (WT) und Pdu MTs (ΔPduN) enthalten, weisen beide eine niedrigere Spitzenkonzentration an Propionaldehyd auf als der Stamm mit gebrochenem Kompartiment (ΔPduA PduJ); Allerdings ist der Aufbau von Propionaldehyd beim Pdu MT-Stamm etwas schneller als beim Pdu MCP-Stamm, bei dem nach 9 Stunden Wachstum nachweisbare Propionaldehydspiegel vorhanden sind (Abb. 4c). Dies deutet darauf hin, dass die Änderung der Geometrie von MCP zu MT den passiven Substrattransport in und aus dem Kompartiment subtil verändert und sich auf die Zugänglichkeit von Substraten zum enzymatischen Kern auswirkt. Dies könnte entweder auf Veränderungen in der Fachoberfläche oder auf mögliche offene Enden von Pdu-MTs zurückzuführen sein. Bezeichnenderweise weist der Pdu MT-Stamm (ΔPduN) im Vergleich zum Pdu MCP-Stamm (WT) niedrigere Spitzenpropionatkonzentrationen und einen schnelleren Verbrauch von 1-Propanol auf (Abb. 4c). Dies deutet darauf hin, dass unter diesen Wachstumsbedingungen die Pdu-MT-Geometrie eine schnellere Aufnahme von Propionat in den zentralen Stoffwechsel begünstigt, wiederum möglicherweise aufgrund von Änderungen im durchschnittlichen Substrattransport in und aus Pdu-MTs im Vergleich zu Pdu-MCPs. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch die Pdu-MT-Proteinhülle bereitgestellte Diffusionsbarriere ausreicht, um die Bildung toxischen Propionaldehyds im Zytosol zu verhindern.

Da wir beobachteten, dass Stämme, die Pdu-MCPs und Pdu-MTs enthielten, im Laufe der Zeit leicht unterschiedliche Metabolitenprofile aufwiesen, stellten wir die Hypothese auf, dass der Hauptunterschied zwischen den betreffenden Einkapselungsvehikeln, MCPs und MTs, im Verhältnis von Oberfläche zu Volumen dieser Strukturen liegt. Um diese Hypothese zu hinterfragen, haben wir ein kinetisches Modell des Pdu-Signalwegs auf Systemebene36 modifiziert, um das Zellwachstum zu berücksichtigen und die MCP- und MT-Geometrien zu behandeln. Wir haben unser Modell anhand von Literaturwerten parametrisiert und dann die MCP-Permeabilität und die PduP/PduQ-Konzentration angepasst, um sie an die Merkmale der Propionaldehyd-Zeitentwicklung in externen Medien für den Wildtyp-Stamm anzupassen (siehe Ergänzungstabelle 1). Insbesondere wurde die MCP-Permeabilität so angepasst, dass die Zeitskala des Propionaldehydaufbaus und -abbaus mit der in Experimenten beobachteten übereinstimmte, und die PduP/PduQ-Aktivitäten wurden so angepasst, dass der maximale Propionaldehydspiegel die Werte nicht überstieg, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie dramatische Wachstumsstörungen verursachen (<16 mM). 19. Pdu-MCPs werden als Kugeln mit einem Durchmesser von 140 nm20 und 15 MCPs pro Zelle modelliert, wobei die MCP-Permeabilität den Zugang zu im MCP eingekapselten Enzymen steuert (weitere Modelldetails finden Sie in der ergänzenden Methode 2). Die Zeitskalen des extrazellulären 1,2-Propandiol-Verbrauchs und des 1-Propanol/Propionat-Aufbaus in diesem Pdu-MCP-Modell (Abb. 5c) stimmen gut mit unseren experimentellen Daten (Abb. 4c) überein – der 1,2-Propandiol-Verbrauch erfolgt zwischen 10 und 20 Stunden , und nach 10 Stunden wird ein erster Propionat- und 1-Propanol-Aufbau beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass unsere Modellparametrisierung wichtige Merkmale des dynamischen Pdu-Pfadverhaltens korrekt erfasst hat. Wir stellen zwei Diskrepanzen zwischen dem Modell und unseren experimentellen Daten fest: (1) Propionat und 1-Propanol werden in unseren Experimenten schließlich verbraucht, und (2) die beobachteten absoluten Propionaldehydkonzentrationen unterscheiden sich von den im Modell vorhergesagten. Diese Unterschiede sind hauptsächlich auf den Ausschluss nachgeschalteter Reaktionen aus dem Modell sowie auf die Flüchtigkeit und Reaktivität von Propionaldehyd unter experimentellen Bedingungen zurückzuführen und werden in der ergänzenden Diskussion 1 ausführlich erörtert. Angesichts der Tatsache, dass die Zeitskalen des Propionaldehydaufbaus und -verbrauchs mit unserem Modell übereinstimmen, glauben wir, dass unsere Das Modell ist ausreichend genau, um einen Vergleich der Propionaldehydbildung in verschiedenen Kompartimentgeometrien zu ermöglichen.

ein sphärisches MCP-Modell, bei dem sich R auf eine Reaktion eines bestimmten Enzyms und k auf die Diffusion über eine Barriere (die Kompartimenthülle oder Zellmembran) mit einer bestimmten Permeabilität bezieht. b Zylindrisches Pdu-MT-Modell. c Repräsentative Metabolitenprofile in externen Medien, die vom Modell für den kugelförmigen MCP-Basisfall (dicke, leicht transparente Linien) und begrenzte zylindrische MT-Fälle (dünnere, dunklere Linien – durchgezogen für den Fall, bei dem das gleiche interne MT-Volumen angenommen wird) erstellt wurden Gesamt-MCP-Volumen und gestrichelt für den Fall, dass die gesamte MT-Oberfläche als gleich der gesamten MCP-Oberfläche angenommen wird. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um Konzentrationsprofile, die deterministisch unter der Annahme eines Ausgangszustands von 55 mM 1,2-Propandiol in externen Medien berechnet wurden. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes haben wir unser Modell angepasst, um zu untersuchen, wie sich die Änderung der Geometrie des Kompartiments von sphärisch (MCP) auf zylindrisch (MT) auf die Signalwegleistung auswirkt. Wir gehen davon aus, dass Pdu-MTs Zylinder mit einem Durchmesser von 50 nm und einer Länge sind, die der Länge der Zelle (2,5 µm) entspricht. Metaboliten diffundieren durch die Oberfläche entlang der Längsachse des Zylinders in MTs, jedoch nicht an den Enden (siehe ergänzende Methode 2 für weitere Modellierungsdetails und ergänzende Diskussion 1 für eine Diskussion der Diffusion aus den Enden des Zylinders). Der letzte im Modell festzulegende Parameter war dann die Anzahl der Pdu MTs pro Zelle. Um einen direkten Vergleich mit dem sphärischen MCP-Basisfall zu ermöglichen, haben wir im MT-Modell so viele Parameter wie möglich äquivalent gehalten, einschließlich der Enzymzahl. Anschließend haben wir die Auswirkung von Geometrieunterschieden zwischen den Pdu MT- und MCP-Gehäusen getestet, nämlich eine Änderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen zwischen diesen beiden Geometrien. Wir könnten entweder die Gesamtoberfläche oder das eingekapselte Volumen konstant halten, aber nicht beides. Wir haben daher zwei Grenzfälle betrachtet: (1) die gesamte Kompartimentoberfläche ist in den MCP- und MT-Modellen gleich und die Enzymkonzentration steigt oder (2) das Gesamtvolumen ist in den MCP- und MT-Modellen gleich und die Enzymkonzentration ist konstant. Der Vergleich dieser beiden Grenzfälle verdeutlicht den erheblichen Unterschied im relativen Volumen und der Oberfläche für jede dieser Kompartimentgeometrien (Abb. 5c). Wenn die gesamte Kompartimentoberfläche von MTs mit der von sphärischen MCPs übereinstimmt, die Enzymkonzentration jedoch um das 1,9-fache ansteigt, sehen wir im Vergleich zum sphärischen MCP-Fall kaum oder gar keine Veränderung in den Metabolitenprofilen (Abb. 5c). Wenn das gesamte innere Kompartimentvolumen in MTs und MCPs gleich ist, steht in MTs eine 1,9-mal größere Oberfläche für die Metabolitendiffusion zur Verfügung. Aufgrund dieser vergrößerten verfügbaren Diffusionsoberfläche kann 1,2-Propandiol leichter in den MT diffundieren, wo PduCDE es schnell in Propionaldehyd umwandelt. Dies führt zu erhöhten Propionaldehyd-Spitzenwerten (Abb. 5c).

Die experimentellen Pdu-MT-Daten zeigen einen etwas schnelleren Aufbau von Propionaldehyd im ΔPduN-Stamm als im Wildtyp-Stamm, was darauf hindeutet, dass die Gesamtoberfläche dieser MTs möglicherweise etwas größer ist als die der MCPs. Dies steht im Widerspruch zu den Daten zum 1,2-Propandiol-Verbrauch, bei denen der ΔPduN-Stamm 1,2-Propandiol langsamer verbraucht als der Wildtyp-Stamm, was dem entgegengesetzten Trend entspricht, der beobachtet wird, wenn die Oberfläche im Modell vergrößert wird. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass die im Modell untersuchten Geometrieänderungen unsere experimentellen Ergebnisse nicht vollständig erklären können; Die Modellierungsergebnisse beschreiben jedoch klar, wie die Kompartimentgeometrie die Kinetik des eingekapselten Signalwegs beeinflussen kann. Insbesondere legen diese Modellierungsergebnisse nahe, dass die Kompartimentoberfläche ein Schlüsselparameter für die Propionaldehydbildung ist. Tatsächlich zeigt eine lokale Sensitivitätsanalyse aller im Modell verwendeten Parameter, dass die gesamte Kompartimentoberfläche das dominierende morphologische Merkmal ist, das die externe Propionaldehydbildung steuert (weitere Einzelheiten finden Sie in der ergänzenden Diskussion 1 und in den ergänzenden Abbildungen 4 und 5).

Diese Ergebnisse haben sowohl technische als auch biologische Auswirkungen. Im technischen Bereich schlagen sie vor, dass die Form und Geometrie des Fachs einen einzigartigen Ansatz für die Abstimmung der Leistung gekapselter Pfade bietet. Biologisch gesehen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Kompartimentgeometrie eine Rolle bei der Wirksamkeit der toxischen Zwischenretention spielen kann, was auf einen über den strikten Verschluss hinausgehenden Grund für die Bildung kugelförmigerer Kompartimentstrukturen schließen lässt.

Nachdem wir die Bedeutung des Vertex-Proteins PduN für den MCP-Verschluss und den Einfluss der Kompartimentgeometrie auf die Leistung des eingekapselten Signalwegs festgestellt hatten, entwickelten wir als Nächstes einen mikroskopiebasierten Assay zum Screening von Pdu MT versus Pdu MCP-Bildung. Dieser Assay basiert auf der Beobachtung, dass die Pdu-MT-Bildung in vivo zu einem verlängerten, verknüpften Zellphänotyp führt (Abb. 6a).

ein Schema der Phänotypen, die mit der Bildung von Pdu MCP und Pdu MT verbunden sind. b Box- und Whisker-Diagramm der Länge von Zellen, die ordnungsgemäß gebildete MCPs (WT) exprimieren, und Zellen, die MTs (ΔPduN) exprimieren. Zellmessungen wurden über drei biologische Replikate durchgeführt, wobei insgesamt 171 WT-Zellen und 121 ΔPduN-Zellen gemessen wurden. Der angezeigte p-Wert wurde mithilfe eines zweiseitigen t-Tests unter der Annahme ungleicher Varianzen berechnet. Die Box erstreckt sich vom ersten Quartil bis zum dritten Quartil der Daten, die Linie gibt den Median an und die Whisker erstrecken sich von der Box um das 1,5-fache des Interquartilbereichs. c Prozentsatz der Zellen, die 3 oder mehr Bindungen enthielten (definiert als Zellkörper, die durch eine klare Spaltfurche gespalten sind) in MCP-bildenden (WT) und MT-bildenden (ΔPduN) Stämmen. Balken stellen Mittelwerte des Prozentsatzes verknüpfter Zellen über drei biologische Replikate dar. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung über drei biologische Replikate dar. Der angezeigte p-Wert wurde mithilfe eines zweiseitigen t-Tests unter der Annahme ungleicher Varianzen berechnet. Die Quelldaten für die Panels (b) und (c) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Analyse von Mikroskopiedaten von Zellen, die Pdu-MCPs und Pdu-MTs exprimieren, bestätigt, dass der Phänotyp der verlängerten Zellen spezifisch mit der Bildung von Pdu-MTs zusammenhängt. Wir führten eine Mikroskopie durch und maßen sowohl die Länge als auch die Anzahl der Zellen pro Kette von mindestens 100 Zellen über drei biologische Replikate sowohl in einem MCP-bildenden Stamm (WT) als auch in einem MT-bildenden Stamm (ΔPduN). Wir stellen fest, dass die Zelllänge bei MCP-bildenden (1,8 ± 0,4 µm, Fehler ist Standardabweichung) und MT-bildenden (8 ± 6 µm, Fehler ist Standardabweichung) Stämmen signifikant unterschiedlich ist (p < 0,0001) (Abb. 6b) . Darüber hinaus bilden mehr als 80 % der MT-exprimierenden Zellen Ketten aus 3 oder mehr Zellen, wohingegen Zellen, die Pdu-MCPs exprimieren, immer entweder Einzelzellen oder Doppelzellen sind, die sich gerade im Prozess der ordnungsgemäßen Teilung befinden (Abb. 6c). Somit bieten sowohl die Zelllänge als auch der Prozentsatz verknüpfter Zellen eine praktische Anzeige zur Unterscheidung zwischen Stämmen, die Pdu-MCPs und Pdu-MTs exprimieren. Bemerkenswert ist, dass dieser verknüpfte Zellphänotyp dem ähnelt, der beobachtet wird, wenn die selbstassemblierenden Schalenproteine ​​PduA und PduJ in E. coli überexprimiert werden23, ein Phänotyp, der eine schnelle Bewertung der Selbstassemblierungsneigung von Punktmutanten dieser Hexamer44 ermöglicht hat. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass eine ähnliche Strategie genutzt werden könnte, um nach der Bildung von Pdu MT zu suchen. Wichtig ist, dass wir wissen, dass sich Pdu-MCPs bilden, wenn PduN in die Kompartimenthülle integriert wird, und dass sich Pdu-MTs bilden, wenn PduN nicht in die Kompartimenthülle integriert wird. Folglich können wir diesen MT-bezogenen Phänotyp verwenden, um zu bestimmen, ob PduN-Punktmutationen den Einbau in die Kompartimenthülle verhindern oder zulassen – verknüpfte Zellen würden aus einem nicht inkorporierenden PduN-Punktmutanten resultieren, der die MT-Bildung verursacht, während nicht verknüpfte Zellen aus einem PduN resultieren würden Punktmutante, die korrekt in MCPs eingebaut wird.

Wir veranschaulichen den Nutzen dieser phänotypischen Auswertung für das Screening des PduN-Einbaus, indem wir Punktmutantenbibliotheken von zwei Resten in PduN testen – einem Glycin an Position 52 in PduN (G52) und einem Threonin an Position 88 (T88). Wir stellten die Hypothese auf, dass G52 höchst unveränderlich sein würde, da es in der vorhergesagten Grenzfläche zwischen PduN und PduA vergraben ist (Abb. 7a) und die Hinzufügung einer Seitenkettengruppe voraussichtlich die Stabilität dieser Grenzfläche sterisch stören würde15. Wie erwartet führen die meisten Mutationen an diesem Rest zu einer hohen Population verknüpfter Zellen (>60 %, Abb. 7b, oben), was darauf hindeutet, dass diese Punktmutanten Pdu-MTs bilden. Tatsächlich bestätigen Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie, dass Zellen, die das Pdu-Operon mit PduN-G52C exprimieren, verlängerte Pdu-MT-Strukturen enthalten (Abb. 7c). Die Prävalenz des verknüpften Zellphänotyps, der mit der MT-Bildung verbunden ist, in allen PduN-G52-Punktmutanten legt nahe, dass diese Mutationen den Einbau von PduN in die MCP-Hülle nicht zulassen und somit zeigen, dass der G52-Rest äußerst unveränderlich ist. Interessanterweise zeigt eine Punktmutante, G52N, bei der das Glycin zu Asparagin mutiert ist, einen geringeren Prozentsatz verknüpfter Zellen als der PduN-Knockout (p < 0,01, zweiseitiger t-Test unter der Annahme ungleicher Varianzen). Die Fluoreszenzmikroskopie an diesem Punktmutanten legt nahe, dass es in diesen Zellen eine Mischung von Strukturen gibt, was durch die Kombination von fluoreszierenden Puncta und Streifen in diesen Bildern belegt wird (Abb. 7c). TEM an dünnen Zellschnitten und gereinigten Kompartimenten bestätigt diesen Befund und zeigt das Vorhandensein sowohl polyedrischer als auch länglicher Strukturen (ausführliche Diskussion siehe ergänzende Diskussion 2). Dieses Ergebnis legt nahe, dass das Ausmaß der Zellverlängerung semiquantitativ sein könnte, da kürzere, aber immer noch verbundene Zellen eine gemischte Population von Pdu-MCPs und MTs enthalten.

eine Bandstruktur der PduA-PduN-Schnittstelle (entnommen aus den in Abb. 3 gezeigten 40°-Biegewinkelsimulationen), die die beiden in dieser Arbeit mutierten Reste hervorhebt – Glycin 52 (G52) in Lila, das in der Schnittstelle vergraben ist, und Threonin 88 (T88) in Gelb, das sich oben an der PduA-PduN-Schnittstelle befindet. b Prozent verknüpfter Zellpopulationen (definiert wie in Abb. 6) für Stämme, die das pdu-Operon mit allen möglichen Punktmutationen an Position 52 in PduN (oben) und Position 88 in PduN (unten) exprimieren. Die Balken stellen den durchschnittlichen Prozentsatz verknüpfter Zellen über drei biologische Replikate dar. Fehlerbalken geben die Standardabweichung in Prozent verknüpfter Zellen über drei biologische Replikate an. Insgesamt wurden für jede Punktmutante mindestens 100 Zellen gezählt. Die spezifische Anzahl der für jede Punktmutante gezählten Zellen ist in der Ergänzungstabelle 2 verfügbar. Grüne Hervorhebungen zeigen Punktmutanten an, die für eine detailliertere Validierung der Pdu-MCP- versus Pdu-MT-Bildung ausgewählt wurden. c Detaillierte Charakterisierung der Pdu-Kompartiment- oder Röhrenstrukturen, die in Gegenwart verschiedener PduN-Punktmutanten gebildet werden. Maßstabsbalken in optischen und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen sind 2 μm. Pfeile in mikroskopischen Dünnschnittaufnahmen von Zellen weisen auf proteinreiche Strukturen hin. Mit Coomassie gefärbtes SDS-PAGE-Gel wird mit den Banden markiert, die für verschiedene Pdu-Proteine ​​oder Lysozym (Lys) erwartet werden. Ähnliche Ergebnisse wurden bei drei unabhängigen biologischen Replikaten für optische Mikroskopie- und SDS-PAGE-Experimente beobachtet. Die TEM-Bildgebung gereinigter Kompartimentstrukturen und dünner Zellschnitte wurde nur einmal durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir die Veränderlichkeit des Rests T88 in PduN, der sich oben an der PduA/PduN-Schnittstelle befindet (Abb. 7a). Wir stellten die Hypothese auf, dass dieser Rest einer Mutation zugänglich wäre, da er nicht in der Pentamer/Hexamer-Schnittstelle (PduN/PduA) eingebettet ist. Zellen, die Kompartimente mit PduN-T88-Punktmutanten exprimierten, führten alle zu geringen (<30 %) verknüpften Zellpopulationen (Abb. 7b, unten). Selbst eine Mutation zu Prolin, einer Aminosäure, die typischerweise die Proteinstruktur stört, führt nur dazu, dass 23 ± 1 % der Zellpopulation verknüpft werden. Diese Kombination der Ergebnisse legt nahe, dass Stämme, die Kompartimente mit PduN-T88-Punktmutanten exprimieren, im Allgemeinen wohlgeformte Pdu-MCPs produzieren. Daraus schließen wir, dass dieser T88-Rest in PduN stark veränderbar ist. Wir haben das Vorhandensein wohlgeformter Pdu-MCPs im Stamm ΔPduN::PduN-T88A mithilfe einer Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie, TEM und SDS-PAGE bestätigt (Abb. 7c). Wie erwartet zeigt die Fluoreszenzmikroskopie eine über die Zelle verteilte punktförmige Fluoreszenz, ein Indikator für wohlgeformte MCPs. TEM an dünnen Zellschnitten bestätigt diesen Befund und zeigt Proteinstrukturen, die denen des Wildtyp-Stamms ähneln, der Pdu-MCPs exprimiert (Abb. 7c, 2c). TEM an aus diesen Stämmen gereinigten Kompartimenten bestätigen die Bildung charakteristischer polyedrischer Strukturen (Abb. 7c), und die Coomassie-gefärbte SDS-PAGE an denselben gereinigten Kompartimenten zeigt, dass der Proteingehalt in diesen Kompartimenten dem von Kompartimenten ähnelt, die aus enthaltenden Zellen gereinigt wurden ein Wildtyp-PDU-Operon.

Zusammengenommen veranschaulichen diese Ergebnisse den Nutzen dieses verlängerten, verknüpften Zellphänotyps bei der Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen, die für den Kompartimentverschluss wichtig sind. Wir stellen fest, dass der Assay leicht zwischen PduN-Punktmutanten unterscheidet, die den Kompartimentschluss zulassen und stören, was durch die in unseren G52- und T88-Punktmutantenbibliotheken beobachteten unterschiedlichen Trends belegt wird. Wir gehen davon aus, dass sich dieser mikroskopiebasierte Assay zum Screening der Funktionalität von PduN-Punktmutanten, der den PduN-Einbau an einen verknüpften Zellphänotyp knüpft, sowohl in der Grundlagenwissenschaft als auch im technischen Kontext als nützlich erweisen wird.

Es besteht großes Interesse daran, MCPs für metabolische Engineering-Anwendungen umzuwidmen, wo sie das Potenzial haben, Engpässe wie langsame Reaktionswegkinetik, toxische Zwischenproduktbildung und Cofaktorkonkurrenz zu beseitigen2,11. Während beim kontrollierten Laden nicht-heimischer Fracht in diese Systeme Fortschritte erzielt wurden40,51,52,53,54,55,56, fehlen die Auswahlkriterien für ein MCP-System in einer bestimmten technischen Anwendung. Dazu gehören MCP-Merkmale wie Größe und Morphologie. Hier berichten wir über eine ausführliche Charakterisierung einer alternativen Pdu-Kompartimentgeometrie, Pdu MTs, die sich bilden, wenn das Vertex-Protein PduN nicht in die Pdu-Hülle eingebaut werden kann. Interessanterweise ist diese Veränderung der Morphologie beim Verlust von BMV-haltigen Proteinen nicht in allen Kompartimentsystemen universell – in Abwesenheit von Vertexproteinen bilden β-Carboxysomen längliche Strukturen ähnlich den Pdu-MTs34, aber α-Carboxysomen bilden überwiegend regelmäßige Ikosaeder35. Darüber hinaus können andere Metabolosomen in Abwesenheit von Pentameren geschlossene Ikosaeder bilden53,54,57,58. Wir vermuten, dass dies eine Folge der molekularen Wechselwirkungen zwischen Schalenproteinen sein könnte, insbesondere des bevorzugten Biegewinkels zwischen diesen Schalenproteinen. In diesem Zusammenhang gehen wir davon aus, dass MD-Simulationen wichtige Erkenntnisse zum Verständnis der Unterschiede zwischen Kompartimentsystemen liefern können.

Ein Vergleich des Wachstums und der Signalwegleistung in Zellen, die Pdu MTs und Pdu MCPs exprimieren, zeigte, dass Pdu MTs die Bildung des toxischen Propionaldehyd-Zwischenprodukts im nativen Pdu-Signalweg verhindern. In Verbindung mit unserem kinetischen Modell auf Systemebene legt dieses Ergebnis nahe, dass Pdu-MTs eine Diffusionsbarriere zwischen dem Zytosol und dem eingekapselten Enzymkern darstellen. Wir stellen jedoch fest, dass die Morphologieänderung von kugelförmigen MCPs zu zylindrischen MTs zwangsläufig das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen des Kompartiments verändert. Wir gehen davon aus, dass sich das unterschiedliche Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, das diese Pdu-MT-Strukturen bieten, als vorteilhaft für konstruierte eingekapselte Pfade mit unterschiedlichen kinetischen Profilen erweisen wird. Zukünftige Analysen verschiedener eingekapselter Pfade über verschiedene Kompartimentgeometrien hinweg werden diesbezüglich wertvolle Erkenntnisse liefern.

Die Entdeckung einer Genotyp-Phänotyp-Verbindung für die Pdu-MT-Bildung bietet eine mikroskopische Methode zum Screening der Bildung dieser Strukturen, die weder eine langwierige Reinigung noch spezielle Ausrüstung erfordert. Im Zusammenhang mit dem Verständnis der MCP-Assemblierung ermöglicht dies eine schnelle Charakterisierung der Fitness und Veränderlichkeit verschiedener interagierender Reste in Schalenproteinen wie PduN und PduA. Für technische Zwecke bietet dieser Assay eine einfache Methode zum Screening, ob Punktmutationen an PduN den Einbau von PduN in die Pdu-MCP-Hülle ermöglichen. Dies könnte sich als nützlich für den Einbau reaktiver Griffe in dieses Schalenprotein erweisen, was angesichts des potenziellen Nutzens des Einbaus nichtkanonischer Aminosäuren in MCPs besonders vielversprechend ist59,60. Zusammengenommen bringt uns dies der Ausschöpfung des vollen Potenzials von MCPs als technisch umsetzbare Bionanoreaktoren einen Schritt näher.

Die für PduN kodierende Sequenz wurde mithilfe der Golden Gate-Klonierung61 in einen Golden Gate-kompatiblen pBAD33t-Elternvektor (p15a-Replikationsursprung, Chloramphenicol-Resistenz-Selektionskassette, Arabinose-induzierbarer Promotor) kloniert61. Beim Klonen wurde der PduN-Sequenz ein C-terminales 6xHistidin- oder FLAG-Tag hinzugefügt. Alle Primer sind in den Zusatzdaten 3 aufgeführt, und alle erzeugten Plasmide sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt. Die gesamte Klonierung wurde unter Verwendung von Escherichia coli DH10b-Zellen durchgeführt.

Alle PduN-Punktmutanten wurden zunächst in der PduN-Sequenz erzeugt, die vor der Integration in das Salmonella-Genom in den oben genannten pBAD33t-Vektor kloniert wurde (Rekombinationsmethoden siehe unten). PduN-Punktmutanten an Glycin 52 (G52) wurden mithilfe ortsgerichteter QuikChange-Mutagenese mit KOD Hot Start DNA-Polymerase (Sigma-Aldrich) auf einer PduN-Sequenz erzeugt. PduN-Punktmutanten bei Threonin 88 (T88) wurden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Eintrittsvektormethode erzeugt62,63. Kurz gesagt wurde die Gibson-Assemblierung verwendet, um die Aminosäuren 80–91 in PduN durch ein konstitutiv aktives GFP-Gen zu ersetzen, das von zwei BsaI-Stellen flankiert wird. Punktmutanten wurden dann als einzelsträngige DNA-Primer geordnet, flankiert von BsaI-Schnittstellen, die zu denen im Eintrittsvektor komplementär waren. Der Rückstrang wurde mittels PCR mit 12-meren aufgefüllt, die auf die Golden-Gate-Schnittstellen gerichtet waren. Doppelsträngige DNA wurde mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und in Golden-Gate-Assemblierungsreaktionen mit dem Eintrittsvektor verwendet. Kandidatenklone wurden mittels Grün-Weiß-Screening gescreent. Die Sequenzen aller erzeugten Punktmutantenplasmide wurden durch Sanger-Sequenzierung (Genewiz) bestätigt.

Alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme sind in den ergänzenden Daten 1 aufgeführt. Die Rekombination wurde unter Verwendung der λ-Rot-Rekombination wie zuvor beschrieben durchgeführt64. Kurz gesagt wurden genetische Veränderungen vorgenommen, indem zunächst das Gen am interessierenden Ort durch eine Kassette ersetzt wurde, die für ein Chloramphenicol-Resistenzgen (Katze) und ein Saccharose-empfindliches Gen (sacB) kodiert. Diese cat/sacB-Selektionskassette wurde aus dem TUC01-Genom64,65 unter Verwendung von Primern amplifiziert, die dem interessierenden genomischen Locus Homologie hinzufügten. Der genomische Einbau dieser Kassette wurde durch Selektion auf Lysogenie-Brühe (LB)-Agar, ergänzt mit 10 µg/ml Chloramphenicol, bestätigt, gefolgt von Saccharose-Empfindlichkeitsscreenings ausgewählter Kolonien auf LB-Agar-Platten, ergänzt mit 6 % (Gew./Gew.) Saccharose. Als nächstes wurde die cat/sacB-Selektionskassette durch die DNA ersetzt, die für das gewünschte Gen kodiert, wobei entweder einzelsträngige DNA für Knockouts oder gereinigte PCR-Produkte für vollständige Gene verwendet wurden. PCR-Produkte, die für den Einbau von PduN-Punktmutanten am pduN-Locus oder den Einbau von ssD-GFP am pduD-Locus verwendet wurden, wurden aus dem jeweiligen Plasmid unter Verwendung von Primern amplifiziert, die dem interessierenden Genom-Locus Homologie hinzufügten. Der Ersatz der cat/sacB-Selektionskassette durch die interessierende DNA wurde zur Verwendung der Saccharose-Empfindlichkeit ausgewählt. Die Sequenz der Klone wurde durch Sanger-Sequenzierung an PCR-Produkten bestätigt, die aus dem Genom am interessierenden Ort amplifiziert wurden.

Das S. enterica-Wachstum für alle Experimente ohne Wachstumskurve wurde wie folgt durchgeführt. Übernachtkulturen wurden aus einzelnen Kolonien in 5 ml LB, Lennox-Formulierung (LB-L) geimpft und 24 Stunden lang bei 30 °C und 225 U/min gezüchtet. Für Experimente, bei denen PduN-FLAG von einem Plasmid exprimiert wurde, wurden Übernachtkulturen mit 34 µg/ml Chloramphenicol ergänzt. Über Nacht wurden 1:1000 Subkulturen in 5 ml No Carbon Essential (NCE)-Medium (29 mM monobasisches Kaliumphosphat, 34 mM dibasisches Kaliumphosphat, 17 mM Natrium-Ammoniumhydrogenphosphat), ergänzt mit 50 µM Eisencitrat, 1 mM Magnesiumsulfat, 42 mM, subkultiviert Succinat als Kohlenstoffquelle und 55 mM 1,2-Propandiol als Induktor des pdu-Operons. Für Experimente, bei denen PduN-FLAG von einem Plasmid ergänzt wurde, wurde das Medium mit 34 µg/ml Chloramphenicol und der angegebenen Menge Arabinose ergänzt, beides wurde zum Zeitpunkt der Subkultur hinzugefügt. Die Zellen wurden in einem 24-Well-Block 16 Stunden lang bei 37 °C und 225 U/min gezüchtet und dann für bildgebende Experimente vorbereitet (siehe Fluoreszenz-/Phasenmikroskopie und Dünnzellschnitt-TEM unten).

Die MCP-Expression und -Reinigung wurde mithilfe der Differentialzentrifugation wie zuvor beschrieben durchgeführt39,66. Kurz gesagt, die Übernachtkulturen wurden mit einer einzelnen Kolonie in 5 ml LB-L begonnen und bei 37 °C und 225 U/min gezüchtet. Über Nacht wurde bei Stämmen, in denen PduN-FLAG von einem Plasmid exprimiert wurde, 34 µg/ml Chloramphenicol ergänzt. Über Nacht wurden 1:1000 in 200 ml NCE subkultiviert (erneut ergänzt mit Eisencitrat, Magnesiumsulfat, Succinat und 1,2-Propandiol, wie oben) und bei 37 °C und 225 U/min gezüchtet, bis die OD600 1–1,5 erreichte. Kulturen für Stämme, in denen PduN-FLAG von einem Plasmid exprimiert wurde, wurden mit 34 µg/ml Chloramphenicol und 0,02 % (Gew./Gew.) Arabinose ergänzt, die beide zum Zeitpunkt der Subkultur hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4500 × g, 5 Min.) geerntet und in Lysepuffer (32 mM Tris-HCl, 200 mM Kaliumchlorid (KCl), 5 mM Magnesiumchlorid (MgCl2), 0,6 % (v/v) 1 resuspendiert ,2-Propandiol, 0,6 % (w/w) Octylthioglucosid (OTG), 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,8 mg/ml Lysozym (Thermo Fisher Scientific), 0,04 Einheiten/ml DNase I (New England Biolabs, Inc.), pH 7,5 –8,0). Resuspendierte Zellen konnten in diesem Puffer durch 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur lysieren. Das Lysat wurde dann durch zwei Zentrifugationsrunden (12.000 × g, 5 Min., 4 °C) geklärt. MCPs oder MTs wurden vom Lysat durch Ultrazentrifugation in einem Ausschwingrotor (21.000 × g, 20 Min., 4 °C) abgetrennt und mit Puffer (32 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,6 % (v/) gewaschen. v) 1,2-Propandiol, 0,6 % (w/w) OTG, pH 7,5–8,0) und dann erneut zentrifugiert (21.000 × g, 20 min, 4 °C). MCP- oder MT-Pellets wurden dann in Puffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 % (v/v) 1,2-Propandiol, pH 8,0) resuspendiert. Anschließend wurden in der Probe verbleibende Zelltrümmer durch drei 1-minütige Zentrifugationen bei 12.000 × g entfernt. Gereinigte MCPs oder MTs wurden bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Der Proteingehalt gereinigter MCP- oder MT-Proben wurde mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gepaart mit Coomassie-Blau-Färbung oder Anti-FLAG-Western-Blot bewertet. Die Beladung mit gereinigten MCP- oder MT-Proben wurde durch die Gesamtproteinkonzentration, bestimmt durch einen Bicinchoninsäure-Assay, normalisiert, so dass 1,5 µg Protein pro Spur geladen wurden. Die Proben wurden in Laemmli-Puffer verdünnt und vor dem Laden 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Die Proben wurden auf 15 % (Gew./Gew.) Polyacrylamid-Tris-Glycin-Minigelen 90 Minuten lang bei 120 V aufgetrennt. Das Protein wurde durch Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sichtbar gemacht.

Proben für den Western Blot wurden wie oben vorbereitet und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proben wurden mit einem Bio-Rad Transblot SD bei 25 V, 150 mA 35 Minuten lang auf eine Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) übertragen. Die Membran wurde in TBS-T (20 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 0,05 % (v/v) Tween 20, pH 7,5)) mit 5 % (w/w) Trockenmilch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert Temperatur. Die Membran wurde dann mit einem Maus-Anti-FLAG-Primärantikörper (MilliporeSigma Cat# F3165), verdünnt 1:6666 in TBS-T mit 1 % (w/w) Trockenmilch, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur sondiert. Die Membran wurde mit TBS-T gewaschen und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Ziegen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-Sekundärantikörper (Invitrogen Cat# 32430), 1:1000 in TBS-T verdünnt, inkubiert. Abschließend wurde die Membran mit TBS-T gewaschen und anschließend mit SuperSignal™ West Pico PLUS Chemilumineszenzsubstrat (Thermo Fisher Scientific) entwickelt und mit einem Bio-Rad ChemiDoc XRS + System, ausgestattet mit Bio-Rad Image Lab-Software, abgebildet.

Die Zellen wurden für die Mikroskopie auf gefrosteten Fisherbrand™-Objektträgern (Thermo Fisher Scientific Kat.-Nr. 12-550-343) vorbereitet und zwischen dem Objektträger und einem 22 × 22 mm großen Deckglas mit der Dicke Nr. 1,5 (VWR Kat.-Nr. 16004-302) eingelegt. Deckgläser und Objektträger wurden vor der Verwendung mit Ethanol gereinigt. Die Zellen wurden auf einem aufrechten Nikon Eclipse Ni-U-Mikroskop mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer Andor Clara-Digitalkamera abgebildet. Für die Bildaufnahme wurde die Software NIS Elements (Nikon) verwendet. GFP-Fluoreszenzbilder wurden mit einem C-FL Endow GFP HYQ-Bandpassfilter aufgenommen. Für alle Fluoreszenzbilder wurde eine Belichtungszeit von 200 ms verwendet. Helligkeit und Kontrast in Bildern eines bestimmten Experiments wurden in ImageJ67 auf die gleichen Werte eingestellt. Die Zelllänge wurde mit dem segmentierten Linientool in ImageJ67 quantifiziert. Die Identifizierung verknüpfter Zellen erfolgte wie zuvor beschrieben23. Kurz gesagt, jeder Zellkörper, der drei oder mehr Zellkörper enthielt, die durch eine erkennbare Spaltfurche getrennt waren, wurde als verbunden gezählt, wohingegen Zellkörper, die zwei oder weniger Zellen (oder eine oder weniger Spaltfurche) enthielten, als nicht verbunden galten. Jeder Zellkörper in einem Satz verbundener Zellen wurde als einzelnes Zellereignis gezählt.

Gereinigte MT- oder MCP-Proben wurden wie zuvor beschrieben vorbereitet und mit Negativfärbungs-TEM abgebildet20. Kurz gesagt, die Proben wurden auf 400 Mesh Formvar-beschichteten Kupfergittern (EMS Cat# FF400-Cu) unter Verwendung einer 2 % (v/v) Glutaraldehyd-in-Wasser-Lösung fixiert. Fixierte Proben wurden mit reinem MilliQ™-Wasser gewaschen und mit 1 % (Gew./Gew.) Uranylacetatlösung angefärbt. Die Gitter wurden vor der Bildgebung getrocknet und gelagert. Die Gitter wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop JEOL 1230 abgebildet, das mit einer unten montierten CCD-Kamera Gatan 831 ausgestattet war. Messungen des MT-Durchmessers wurden mit dem segmentierten Linienwerkzeug in ImageJ67 durchgeführt.

Probenzellen wurden in 2 % (v/v) Paraformaldehyd und 2,5 % (v/v) EM-Glutaraldehyd in einem 0,1 M PIPES-Puffer, pH 7,4, fixiert und chemisch mit Osmiumtetroxid verarbeitet, mit Ethanol und Aceton dehydriert und mit EMBed812 infiltriert Epoxidharz in einem mPrep ASP1000 Automated Sample Processor. Die infiltrierten Proben wurden in Blockformen mit reinem Harz eingebettet und 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert. Ultradünne 60-nm-Schnitte der eingebetteten Zellen wurden mit einem Leica UC7 Ultramikrotom und einem DiATOME 35-Grad-Diamantmesser geschnitten. Die Schnitte wurden auf Cu-Schlitzgittern mit einer Formvar/Kohlenstoff-Membran gesammelt und mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt, um den Eigenkontrast im Elektronenmikroskop zu verstärken. Probenabschnitte wurden bei 200 kV in einen Hitachi HD2300 cFEG STEM geladen und mit den TE-Phasenkontrast- und HAADF-Z-Kontrastdetektoren abgebildet. Die Bilddaten wurden mit DigiScan gesammelt, einem E-Beam-Rasterdatenerfassungssystem innerhalb von Gatan Digital Micrograph.

Wachstumstests für 1,2-Propandiol als einzige Kohlenstoffquelle wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt23,49. Kurz gesagt, wurden einzelne Kolonien über Nacht in 5 ml Terrifik-Brühe (TB) ohne Glycerin (Dot Scientific, Inc.) inokuliert und 15–16 Stunden lang bei 37 °C unter Orbitalschütteln bei 225 U/min gezüchtet. Über Nacht wurden Subkulturen bis zu einer OD600 von 0,05 in NCE-Medium, ergänzt mit 50 µM Eisencitrat, 1 mM Magnesiumsulfat, 150 nM Adenosylcobalamin und 55 mM 1,2-Propandiol, durchgeführt. Die Kulturen wurden in folienverschlossenen 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen bei 37 °C und 225 U/min gezüchtet.

Zu jedem Zeitpunkt wurde ein 500-µL-Aliquot der Kultur entnommen, um die OD600- und Metabolitenspiegel zu quantifizieren. OD600 wurde mit einem BioTek Synergy HTX Multimode-Plattenlesegerät gemessen und in eine äquivalente OD600 für eine Weglänge von 1 cm umgerechnet. Nach neun Stunden wurden Kulturproben aller Stämme außer ΔPocR vor der OD600-Messung 1:5 in frischem NCE verdünnt, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich des Instruments durchgeführt wurden. Fehlerbalken auf Wachstumskurven stellen die Standardabweichung über drei biologische Replikate dar.

Zellkulturproben, die nicht für die OD600-Messung verwendet wurden, wurden 5 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert, um Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt und bei –20 ° C eingefroren. Vor der HPLC-Analyse wurden die Proben aufgetaut und filtriert (Corning™ Costar™ Spin-X LC-Filter). Die gefilterten Proben wurden auf einem Agilent 1260 HPLC-System analysiert und mit einer Rezex™ ROA-Organic Acid H + (8 %) LC-Säule (Phenomenex) bei 35 °C getrennt. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 5 mM Schwefelsäure als mobiler Phase und einem Durchfluss von 0,4 ml/min. Metaboliten wurden mit einem Brechungsindexdetektor (RID)19 nachgewiesen, wobei Peaks im RID-Spektrum nach 30 Minuten für 1,2-Propandiol, 33 Minuten für Propionat, 39 Minuten für Propionaldehyd und 46 Minuten für 1-Propanol beobachtet wurden. Die Metabolitenkonzentrationen wurden aus Peakflächen berechnet, die in der Agilent ChemLab-Software unter Verwendung von Standards der interessierenden Metaboliten (1,2-Propandiol, Propionaldehyd, Propionat, 1-Propanol) bei 200, 100, 50, 20 und 5 mM berechnet wurden. Fehlerbalken bei den gemeldeten Metabolitenkonzentrationen stellen die Standardabweichung über drei biologische Replikate dar.

Die Ausgangsstruktur für das atomistische Modell der PduA/PduN-Schnittstelle wurde wie folgt generiert. Die PduA-Struktur wurde aus PDB 3NGK25 übernommen. Die Struktur der PduN-Untereinheit wurde mithilfe des Phyre2-Webportals68 geschätzt. Die Pentamerstruktur wurde dann generiert, indem fünf Kopien dieser PduN-Untereinheitsstruktur mit der aus PDB 5V7415 extrahierten BMC-P-Struktur mithilfe des MatchMaker-Tools in UCSF Chimera abgeglichen wurden69,70. Diese Struktur wurde dann mithilfe der Standardparameter im Minimize Structure-Tool von UCSF Chimera minimiert. Um die PduA/PduN-Schnittstelle aufzubauen, wurde eine BMC-H/BMC-P-Schnittstelle aus PDB 5V74 extrahiert, bei dem es sich um eine gelöste Kristallstruktur eines vollständigen Mikrokompartiments von Haliangium ochraceum15 handelt. Anschließend wurde das MatchMaker-Tool von Chimera verwendet, um das PduA-Hexamer und das PduN-Pentamer an den BMC-H- bzw. BMC-P-Strukturen auszurichten. Die PduA/PduN-Schnittstellenstruktur wurde dann erneut minimiert, indem die Standardparameter im Tool „Struktur minimieren“ von Chimera verwendet wurden69. Die PduA/PduA-Schnittstelle wurde auf die gleiche Weise generiert, außer dass eine BMC-H/BMC-H-Schnittstelle aus der PDB 5V74-Struktur verwendet wurde.

Vor der Durchführung der Simulationen wurden die Modelle PduA/PduA und PduA/PduN in Wasser mit 100 mM NaCl solvatisiert. Unter Verwendung der GROMACS-Molekulardynamik-Engine71 wurde das System einem 100-ps-Konstantdruck-Temperatur-Gleichgewicht (NPT) unterzogen, wobei die Proteinrückgrate zurückgehalten wurden. Anschließend wurden gesteuerte MD-Simulationen durchgeführt, um Konfigurationen zu erstellen, bei denen die Proteine ​​viele verschiedene Biegewinkel oder Abstände annehmen (abhängig von der Art der Berechnung). Zur Berechnung des Biegepotentials wurde das Protein darauf beschränkt, sich nur in zwei Dimensionen zu bewegen, sodass sich nur der Biegewinkel zwischen den beiden Proteinen ändern konnte. Anschließend wurde eine Schirmprobenahme in z-Richtung durchgeführt und wieder auf die θB-Richtung abgebildet, wobei die Kräfte in z-Richtung in solche in θB-Richtung umgewandelt wurden, wie in der ergänzenden Methode 1 beschrieben. Für die gesamte Wechselwirkungsstärke des PduA/PduN-Standardschirms Probenahme angewendet wird. Weitere Einzelheiten zu AA-MD-Simulationen finden Sie in der ergänzenden Methode 1.

Das zur Simulation des Pdu-Signalwegs verwendete kinetische Modell wurde gegenüber früheren Arbeiten36 modifiziert und wird in der ergänzenden Methode 2 ausführlich beschrieben. Hier gingen wir über die Steady-State-Analyse hinaus und analysierten die Metabolitenprofile über die Zeit, um die Wachstumsbedingungen in unseren Experimenten widerzuspiegeln . Wir haben auch die externen Medien explizit modelliert und den Anstieg der Zellzahl basierend auf den experimentellen Wachstumskurvendaten berücksichtigt. Wir berechnen die Dynamik der Metaboliten 1,2-Propandiol, Propionaldehyd, Propionyl-CoA, 1-Propanol und Propionat im MCP/MT-Innenraum, im Zytosol und in den Medien. Da die Metabolitendiffusion mit jeder Region viel schneller ist als die Enzymkinetik und der Transport durch die Zellmembran oder MT/MCP-Hülle, gehen wir davon aus, dass jedes Volumen gut gemischt ist und keine räumlichen Variationen aufweist. Daher ist die Hauptkonsequenz der gewählten Geometrie die Oberfläche und das Volumen jeder Region.

Unser Modell geht davon aus, dass MCPs Kugeln mit einem Durchmesser von 140 nm und MTs Zylinder mit einem Durchmesser von 50 nm und einer Länge sind, die der der Zelle entspricht. Metaboliten diffundieren passiv in kugelförmige MCPs über die gesamte Kugeloberfläche mit einer Geschwindigkeit, die durch die Permeabilität der Hülle bestimmt wird. Bei MTs können Metaboliten nur entlang der Längsachse des Zylinders und nicht an den Enden in das zylindrische Volumen diffundieren, wobei wiederum die Geschwindigkeit durch die Permeabilität der Hülle bestimmt wird. Ein alternatives Modell, das die Diffusion aus den MT-Enden berücksichtigt, wird in der ergänzenden Methode 2 ausführlich beschrieben. Es wird angenommen, dass die Permeabilität der MCPs/MTs für alle Metaboliten gleich ist. In einer Zelle ist jederzeit eine festgelegte Anzahl von MCPs oder MTs vorhanden, die durch den Parameter MCPs/MTs pro Zelle festgelegt wird. Es wird angenommen, dass die Zellen kapselförmig sind.

Es wird angenommen, dass alle Enzyme eine Michaelis-Menten-Kinetik aufweisen. Wir gehen davon aus, dass die durch PduCDE, PduP und PduQ katalysierten Reaktionen nur innerhalb des MCP/MT stattfinden können und dass die durch PduL und PduW katalysierten Reaktionen, die Propionyl-CoA in Propionat umwandeln, in einem einzigen Schritt im Zytosol der Zelle ablaufen. Die Umwandlung von 1,2-Propandiol zu Propionaldehyd durch PduCDE wird als irreversibel angenommen. Die Umwandlungen von Propionaldehyd in Propionyl-CoA oder 1-Propanol durch PduP bzw. PduQ gelten beide als reversibel. Die Umwandlung von Propionyl-CoA in Propionat durch PduL/PduW wird als irreversibel angenommen.

Dieses Modell wurde in Python72 implementiert und ist auf GitHub [https://github.com/cemills/MCP-vs-MT]73 verfügbar. Eine detaillierte Beschreibung der Gleichungen finden Sie in der Ergänzungsmethode 2. Die Parameter sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind auf Anfrage erhältlich. Wir haben in dieser Arbeit die PDBs 5V7415 und 3NGK25 verwendet, um Startkoordinaten für die in dieser Arbeit durchgeführten Simulationen aller Atome zu generieren, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Für die kinetische Modellierung verwendete Codes sind auf GitHub [https://github.com/cemills/MCP-vs-MT]73 verfügbar.

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Archer, AG, Mills, CE, Shirman, S., Das Vertex-Protein PduN optimiert die Leistung des eingekapselten Signalwegs, indem es die Morphologie der bakteriellen Metabolosomen bestimmt. https://github.com/cemills/MCP-vs-MT, https://doi.org/10.5281/zenodo.6609067 (2022).

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Die Autoren danken und danken den Mitgliedern der Gruppen Mangan, Olvera de la Cruz und Tullman-Ercek für die aufschlussreichen Diskussionen rund um diese Arbeit. Die Autoren danken Dr. Chris Jakobson ausdrücklich für die in dieser Studie verwendeten Plasmide. Diese Arbeit wurde teilweise vom Army Research Office (Zuschuss W911NF-19-1-0298 an DTE und MCJ) und vom Energieministerium (Zuschuss DE-SC0019337 an DTE und NMM und Zuschuss DE-FG02-08ER46539 an MOdlC) finanziert. NWK wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation (Grant DGE-1842165) und durch das National Institutes of Health Training Grant (T32GM008449) über das Northwestern University Biotechnology Training Program finanziert. MOdlC dankt der Sherman Fairchild Foundation für die rechnerische Unterstützung. Diese Arbeit nutzte die BioCryo-Einrichtung des NUANCE Center der Northwestern University, die Unterstützung von der SHyNE Resource (NSF ECCS-2025633), dem IIN und dem MRSEC-Programm der Northwestern (NSF DMR-1720139) erhielt. Molekulare Grafiken und Analysen, durchgeführt mit UCSF Chimera, entwickelt von der Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics an der University of California, San Francisco, mit Unterstützung von NIH P41-GM103311.

Abteilung für Chemie- und Bioingenieurwesen, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Carolyn E. Mills, Charlotte H. Abrahamson, Michael C. Jewett und Danielle Tullman-Ercek

Abteilung für Materialwissenschaft und Werkstofftechnik, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Curt Waltmann und Monica Olvera vom Kreuz

Fakultät für Ingenieurwissenschaften und Angewandte Mathematik, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Andrew G. Archer, Sasha Shirman und Niall M. Mangan

Interdisziplinäres Programm für Biowissenschaften, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Nolan W. Kennedy und Niall M. Mangan

Master of Science im Biotechnologieprogramm, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Alexander D. Jackson

Experimentelles Zentrum für atomare und nanoskalige Charakterisierung der Northwestern University, Evanston, IL, USA

Eric W. Roth

Zentrum für Synthetische Biologie, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Michael C. Jewett, Niall M. Mangan, Monica Olvera vom Kreuz und Danielle Tullman-Ercek

Fakultät für Chemie, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Monica Olvera de la Cruz

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CEM, CW, NWK, ADJ, MOdlC und DTE haben dieses Projekt konzipiert. CEM, NWK, CHA, ADJ und EWR führten Experimente durch. CW führte atomistische Simulationen durch. Alle Autoren trugen zur Analyse und Interpretation der Daten bei. AGA, SS und NMM trugen zur Entwicklung von Software bei, die im kinetischen Modell auf Systemebene verwendet wird. CEM und DTE haben das Manuskript geschrieben. CEM, CW, AGA, NWK, CHA, ADJ, EWR, SS, MCJ, NMM, MOdlC und DTE haben das Manuskript überprüft und dazu beigetragen.

Korrespondenz mit Danielle Tullman-Ercek.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jon Marles-Wright und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mills, CE, Waltmann, C., Archer, AG et al. Das Vertex-Protein PduN optimiert die Leistung des verkapselten Signalwegs, indem es die Morphologie der bakteriellen Metabolosomen bestimmt. Nat Commun 13, 3746 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31279-3

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Eingegangen: 12. November 2021

Angenommen: 09. Juni 2022

Veröffentlicht: 29. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31279-3

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