Blog

Jun 20, 2023

Die Proteinkonformationsbasis der Isoflavon-Biosynthese

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 1249 (2022) Diesen Artikel zitieren 1022 Zugriffe 1 Zitate 1 Altmetric Metrics Details Isoflavonoide spielen eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr und auch

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1249 (2022) Diesen Artikel zitieren

1022 Zugriffe

1 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Isoflavonoide spielen eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr und weisen auch eine Reihe gesundheitsfördernder Aktivitäten bei Säugetieren auf. Ihre Biosynthese wird durch zwei Enzyme mit ungewöhnlicher katalytischer Aktivität initiiert; 2-Hydroxyisoflavanon-Synthase (2-HIS), ein membrangebundenes Cytochrom P450, das eine gekoppelte Arylringmigration und Hydroxylierung katalysiert, und 2-Hydroxyisoflavanon-Dehydratase (2-HID), ein Mitglied einer großen Carboxylesterase-Familie, die paradoxerweise die Dehydratisierung von 2 katalysiert -Hydroxyisoflavanone zu Isoflavonen. Hier berichten wir über die Kristallstrukturen von 2-HIS aus Medicago truncatula und 2-HID aus Pueraria lobata. Die 2-HIS-Struktur zeigt eine einzigartige Cytochrom-P450-Konformation sowie einen Häm- und Substratbindungsmodus, der die gekoppelten Arylringmigrations- und Hydroxylierungsreaktionen erleichtert. Die 2-HID-Struktur enthüllt die Architektur des aktiven Zentrums und mutmaßliche katalytische Reste für die dualen Dehydratase- und Carboxylesterase-Aktivitäten. Mutagenesestudien deckten Schlüsselreste auf, die an der Substratbindung und -spezifität beteiligt sind. Das Verständnis der strukturellen Grundlagen der Isoflavon-Biosynthese wird die Entwicklung neuer bioaktiver Isoflavonoide erleichtern.

Die Isoflavonoide kommen vor allem in Hülsenfrüchten vor und spielen eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr. Sie haben auch verschiedene östrogene, antiangiogene, antioxidative und krebshemmende Wirkungen, was zu ihrer Beliebtheit als Nahrungsergänzungsmittel führt1,2,3,4. Das Isoflavon Genistein kann das Wachstum von Krebszellen durch Modulation von Genen hemmen, die mit der Kontrolle des Zellzyklus, der Apoptose und der Zellsignalwege zusammenhängen5,6. Isoflavonoide werden über den zentralen Phenylpropanoidweg und den spezifischen Isoflavonoidzweigweg synthetisiert. 2-Hydroxyisoflavanon-Synthase (2-HIS) katalysiert die Einstiegsreaktion in die Isoflavonoid-Biosynthese, um Flavanon in (2R, 3S)-2-Hydroxyisoflavanon umzuwandeln1,7. 2-Hydroxyisoflavanon-Dehydratase (2-HID) katalysiert dann die Dehydratisierung von 2-Hydroxyisoflavanonen, um die ersten Isoflavonprodukte Daidzein oder Genistein8 zu ergeben (Abb. 1). 2-HIS-Gene wurden aus Hülsenfrüchten charakterisiert, darunter Süßholz (Glycyrrhiza echinata)9, Sojabohne (Glycine max)10 und die Modellhülsenfrucht Medicago truncatula11. 2-HID wurde in Sojabohnen8, Süßholz (Glycyrrhiza echinate)8, Kudzu (Pueraria lobata)12 und Lotus japonicus13 identifiziert und charakterisiert.

2-HIS katalysiert die Hydroxylierung und Arylringmigration von Flavanonen (z. B. Liquiritigenin und Naringenin), um sie in 2-Hydroxyisoflavanone umzuwandeln, und 2-HID katalysiert dann die Dehydratisierung von 2-Hydroxyisoflavanonen, um die endgültigen Isoflavonprodukte zu ergeben, z. B. Daidzein oder Genistein .

2-HIS ist ein membranassoziiertes Cytochrom-P450-Enzym, das zur CYP93C-Unterfamilie gehört. Es katalysiert eine einzigartige Reaktion, die sowohl eine Arylringwanderung des aromatischen B-Rings von Position C2 nach C3 als auch eine gekoppelte Hydroxylierungsreaktion durch die Hinzufügung eines Sauerstoffatoms an Position C29 umfasst. 2-HID wird in eine große Carboxylesterase-Familie eingeordnet, funktioniert aber möglicherweise nicht bei der Esterhydrolyse in vivo, obwohl in vitro für Sojabohnen-2-HID mit p-Nitrophenylbutyrat eine schwache Carboxylesterase-Aktivität nachgewiesen wurde8. 2-HID fungiert in vivo als Dehydratase zur Dehydratisierung von 2-Hydroxyisoflavonen. Die molekularen Grundlagen für die Arylringmigrations- und Hydroxylierungsfunktionen von 2-HIS und die Hydrolyse- und Dehydratisierungsfunktionen von 2-HID sind nicht verstanden, ebenso wenig wie ihre katalytischen Mechanismen und Substratspezifitäten.

In Pflanzen kommt eine sehr große Anzahl von P450 vor, von denen viele an der Biosynthese von Naturstoffen14,15 beteiligt sind und die Oxidation verschiedener Substrate im Primär- und Sekundärstoffwechsel katalysieren16. Derzeit sind nur wenige Kristallstrukturen für diese sehr große und wichtige Klasse von Pflanzenenzymen verfügbar, darunter zwei peroxidmetabolisierende P450-Allenoxidsynthasen der Klasse III17,18 und mehrere pflanzliche P450s mit ausschließlich Hydroxylierungsaktivität, z. B. Cinnamat-4-hydroxylase ( CYP73A33) aus Sorghum bicolor19, CYP76AH1 aus Salvia miltiorrhiza20 und CYP90B1, CYP97A3 und CYP97C1 aus Arabidopsis thaliana21,22. Die Mechanismen komplexerer pflanzlicher P450-vermittelter Reaktionen wie der Arylringmigration sind noch nicht verstanden.

Hier berichten wir über die Strukturen von 2-HIS aus M. truncatula und 2-HID aus P. lobata. Die 2-HIS-Kristallstruktur offenbart neue Häm- und Substratbindungsmodi in einer anderen Konformation als alle P450 mit bekannten Strukturen und bietet eine Grundlage für das Verständnis neuer Reaktionsmechanismen sowie Substrat- und Regiospezifitäten innerhalb der pflanzlichen P450-Superfamilie. Die 2-HID-Struktur weist Merkmale auf, die sich von anderen bekannten Dehydratase-Strukturen unterscheiden, aber denen von Carboxylesterasen ähneln. Eine vergleichende Strukturstudie identifizierte außerdem die mutmaßlichen Bindungsstellen für die Substrate, die Architekturen der aktiven Zentren und die katalytischen Reste für die Dehydrataseaktivität und die Carboxylesterasefunktionen. Mutagenesestudien beider Enzyme zeigten Schlüsselreste, die an der Substratbindung und -spezifität beteiligt sind.

Die Kristallstruktur von M. truncatula 2-HIS wurde mithilfe der Methode der anomalen Multiwellenlängendispersion mit einem Selenomethionin-substituierten Enzymkristall in der Raumgruppe P212121 bestimmt. Eine weitere native 2-HIS-Kristallform mit einer P21-Raumgruppe wurde mit einer Auflösung von 2,0 Å gebeugt, und die Struktur wurde mithilfe der molekularen Ersatzmethode bestimmt (Tabelle 1). 2-HIS weist eine gemeinsame CYP-Faltung auf und enthält zwei Domänen mit drei β-Faltblättern und dreizehn α-Helices (Abb. 2, ergänzende Abb. 1, 2). Es gibt zwei Moleküle in einer asymmetrischen Einheit, die ein Dimer (Ergänzende Abbildung 3) mit umfangreichen Wechselwirkungen bilden. Die Strukturen zweier Moleküle in der asymmetrischen Einheit sind einander sehr ähnlich, mit einer quadratischen Mittelwertabweichung (RMSD) von 0,59 Å für 451 Cα-Atome. Die Gesamtstruktur von 2-HIS ähnelt auch der anderer P450, einschließlich des menschlichen P450 2C9 mit einem RMSD von 2,52 Å für 239 Cα-Atome (Ergänzende Abbildungen 1, 2).

Die α-Helices, β-Stränge sowie die N- und C-Termini sind markiert. Abb. 1–6 wurden mit MOLSCRIPT51 und RASTER3D52 oder PyMOL53 erstellt.

Die Häm-Prothesengruppe wurde in der Struktur von 2-HIS mit genau definierter Elektronendichte beobachtet (ergänzende Abbildung 4) und befindet sich hauptsächlich zwischen den Helices I und L, wobei sich die I-Helix auf der distalen Seite und die L-Helix auf der proximalen Seite befindet Seite, umgeben von Helices C und E und der Schleife vor Helix C (Abb. 3a–d). Cystein 449 fungiert als 5. Ligand für das Eisen des Häm-Cofaktors. Bemerkenswerterweise unterscheiden sich jedoch die Position und Ausrichtung des Häms in 2-HIS erheblich von denen anderer P450 (z. B. menschliches P450 2C9). Das Häm wird im Vergleich zu dem im menschlichen P450 2C924,25 in Richtung der Helices C und E bewegt, mit einem Abstand von ~8 Å zwischen dem Häm-Eisen in den beiden Strukturen, und Helix C hat sich ebenfalls um ~7–8 Å verschoben (Abb. 3c). Im Vergleich zu P450 2C9 ist die Ebene des Häm-Protoporphyrin-Rings in 2-HIS um ~50° nach unten geneigt (Abb. 3b). Die beiden Propionatgruppen drehen sich auch um etwa 90° in Richtung der Substratbindungstasche, eine ganz andere Konfiguration als bei klassischen P450s, bei denen beide Propionatgruppen eine starke Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung mit Arg oder anderen basischen Aminosäuren eingehen. In der Struktur von 2-HIS liegen Arg433 und Arg446 nahe an den Häm-Pyrrolringen C und D. Diese Region ist in der 2-HIS-Struktur flexibel, mit unterschiedlichen Konformationen in den Molekülen A und B in der asymmetrischen Einheit. Arg433 in Molekül B bildet eine Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung mit der Propionatgruppe am Häm-Pyrrolring D, aber Arg433 in Molekül A ist relativ weit vom Häm entfernt, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung zwischen Arg433 und Häm dynamisch ist. Dieser Ort befindet sich in der Nähe der Substratbindungsstelle, wie unten beschrieben, und die dynamische Wechselwirkung und Konformation sind wahrscheinlich wichtig für die Substratbindung und Katalyse.

ein Hämmolekül und seine Wechselwirkungen mit 2-HIS. b Ein Vergleich der I-Helices von 2-HIS (in Cyan) und menschlichem P450 2C9 (in Grau). c,d Ein Vergleich der Häm-Bindungsschleife von 2-HIS (in Cyan) und menschlichem P450 2C9 (in Grau). Die Strukturen von Häm und Schlüsselresten, die an der Hämbindung beteiligt sind, werden als Kugel-Stab-Modelle dargestellt und je nach Element eingefärbt: Sauerstoff, rot; Stickstoff, blau; Schwefel, Orange; Eisen, schwarz für 2-HIS und grau für P450 2C9; und Kohlenstoff, grün und gelb für 2-HIS-Reste und Häm und grau und dunkelgrau für P450 2C9-Reste und Häm. Für andere Figuren werden dieselben Atomfarbcodes verwendet, mit Ausnahme derjenigen mit spezifischen Beschreibungen. Die gestrichelten Linien in Abb. 2a zeigen die Wechselwirkungen zwischen Häm und R433 und T438.

Die klassischen P450-Monooxygenasen enthalten eine Signatursequenz (A/GGxD/ETT/S) in der I-Helix26, die als Sauerstoffbindungsmotiv angesehen wird, wobei das konservierte Glycin (Gly298 in menschlichem P450 2C9) auf das Häm und das konservierte Threonin (Thr301) zeigt in P450 2C9) weist auf die Sauerstoffbindungsstelle hin. Die entsprechende Sequenz ist in 2-HIS konserviert, obwohl Ser308 das entsprechende Threonin ersetzt. Allerdings unterscheiden sich die Konformation der I-Helix und ihre Wechselwirkungen mit dem Häm in 2-HIS von denen in P450 2C9 (Abb. 3c). Da sich die Hämgruppe in Richtung N-Terminus der I-Helix verschiebt, sind Gly305 und Ser308 in 2-HIS weit vom Hämeisen und der „Sauerstoffbindungsstelle“ entfernt. Ser308 interagiert immer noch mit dem Häm in einem Abstand von ~3,6 Å zu einer Propionatgruppe des Pyrrolrings D. Ser308 zeigt auch auf die mutmaßliche Substratbindungstasche und könnte mit dem Substrat interagieren (Abb. 3b).

Die I-Helix in 2-HIS ist in der mittleren Region (S303-T306), die ohne klassisches Helixmuster verlängert ist, völlig verzerrt und verschiebt im Vergleich auch ~2-3 Reste in Richtung des N-terminalen Endes der I-Helix mit P450 2C9 (Abb. 3b). Die Häm-Bindungsschleife Thr438-P450 befindet sich auf der proximalen Seite des Häms unmittelbar vor der L-Helix (Abb. 3c, d). Die Konformation der N-terminalen Region der Häm-Bindungsschleife von 2-HIS unterscheidet sich deutlich von der anderer P450; Die Schleife ist am N-terminalen Ende länger und ausgedehnter, wobei Thr438 eine Wasserstoffbindung zu einer Propionatgruppe des Häm-Pyrrol-Rings C bildet und so die Häm-Bewegung von ~8 Å aufnimmt. Der mittlere und der N-terminale Teil erstrecken sich in Richtung des Häm-Protoporphyrin-Rings, da die ~90°-Rotation des Häms mit seiner Propionatgruppe Platz für diese neue Konformation schafft.

Bei den meisten P450 befinden sich die Sauerstoff- und Substratbindungsstellen auf der distalen Seite des Häms. In der 2-HIS-Struktur wurde eine Elektronendichte auf der Oberseite des Häm-Eisens beobachtet, an der möglicherweise ein Wassermolekül angebracht ist. Die Sauerstoffbindungstasche ist relativ klein und von den Aminosäuren Ser118, Val119, Val122, Trp128, Phe301, Ala304 und Thr306 umgeben (Abb. 3a, b). Diese Tasche könnte auch Sauerstoff binden, ist aber nicht groß genug, um als Substratbindungstasche zu dienen. Trp128 und Phe301 könnten für die Kontrolle des Zugangs und der Bindung von Sauerstoff wichtig sein.

Ein beobachtetes Strukturmerkmal von 2-HIS ist eine große Tasche am Rand des Häms, nahe seiner Propionatgruppen (Abb. 4), und dies ist wahrscheinlich die Substratbindungstasche. Die Lage ähnelt der der Substratbindungstaschen in anderen berichteten P450-Strukturen. Durch die Verlagerung des Häms wird die Tasche tief und liegt mit ihrem Boden auf der Schleife vor der Helix L (z. B. Phe437) und in der Nähe der Helices L (Ala455) und K (Phe363). Der Boden dieser Tasche ist etwa 6 Å tiefer als der in anderen bekannten P450-Strukturen, in denen sich Substrate nahe der Oberfläche des Häms befinden. Auch die Konformation der Substrateintrittsbereiche an der Oberseite der Tasche unterscheidet sich erheblich von der in anderen bekannten P450-Strukturen (Abb. 5). Die BC-Schleife vor Helix C in 2-HIS ist etwa elf Aminosäuren kürzer als die entsprechende Helix B´-Region in menschlichem P450 2C9. Die FG-Schleife in 2-HIS ist außerdem etwa acht Aminosäuren kürzer als die entsprechende Region im menschlichen P450 2C5, das zusätzliche Helices F´ und G´ enthält. Diese kürzeren Sequenzen in 2-HIS führen zu einer erheblichen Verschiebung des Eintritts nach unten, etwa 10 Å, in Richtung der neuen Häm-Position.

Die Substrate Liquiritigenin und Häm werden als Kugel-Stab-Modelle mit gelb gefärbten Kohlenstoffatomen und schwarzen Eisenatomen dargestellt. Einige Aminosäurereste in der Substratbindungstasche innerhalb von ca. 4,5 Angström vom Substrat sind markiert und als Kugel-Stab-Modelle mit grün gefärbten Kohlenstoffatomen dargestellt.

Die Konformation wird in zwei unterschiedlichen Ausrichtungen dargestellt, wobei die Ebene des Hämrings senkrecht zum Papier steht und die Hämpropionatgruppen nach vorne zeigen (a) und die Hämpropionatgruppen nach rechts zeigen (b). Die Struktur von 2-HIS wird anhand verschiedener Farben dargestellt: die BC-Schleife (orange), die Helices F und G und die FG-Schleife (grün), Helix I und Strang β1-4 (cyan); und menschliches P450 2C9 ist in Grau. Das Substrat und Häm in 2-HIS werden als Modelle mit dicker Bindung in Gelb bzw. Orange dargestellt, und das Substrat und Häm (Modell mit dünner Bindung) in menschlichem P450 2C9 sind in Gelb bzw. Blau dargestellt.

Die direkte Visualisierung der Substratbindung durch Cokristallisation von 2-HIS mit Substraten und Tränken nativer Kristalle mit Substraten erwies sich wiederholt als erfolglos. Aufgrund der großen Verschiebung des Substrateintrittsbereichs in der 2-HIS-Struktur entsteht ein großer Hohlraum auf der Moleküloberfläche. Interessanterweise passen die N-terminale Region vor Helix A und die Stränge β1-1 und β1-2 eines anderen Moleküls des Dimers in diesen Hohlraum (ergänzende Abbildung 3b). Die Regionen vor und nach der Helix A und die Reste in β2-2 sind mit der N-terminalen Transmembrandomäne bei Pro35 verbunden und interagieren wahrscheinlich mit der Membran, liegen jedoch in der Grenzfläche des Dimers verborgen. Dies kann eine stabile Packung der Moleküle begünstigen, um die Kristallisation zu erleichtern, erklärt aber auch die erfolglose Cokristallisation mit Substraten.

Das molekulare Andocken mit dem Substrat Liquiritigenin zeigte, dass das C3-Atom des Substrats nahe an den Hämpropionatgruppen liegt. Die Wechselwirkungen zwischen Substrat und Enzym sind hauptsächlich hydrophob mit vielen hydrophoben Resten (d. h. Leu113, Val 119, Phe363, Leu369, Val372, Val397, Phe437, Leu439, ​​Leu440 und Leu497) in der Bindungstasche (Abb. 4). Phe363 kann eine starke hydrophobe Wechselwirkung mit dem aromatischen A-Ring des Substrats eingehen. Andere hydrophobe Reste (z. B. Leu369, Val372 und Leu439) können ebenfalls Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit dem Substrat eingehen. Allerdings werden auch polare Reste in der Substratbindungstasche beobachtet, Asn117 könnte über eine Wasserstoffbrücke mit dem Substrat interagieren und Ser308 liegt sowohl dem Häm als auch dem Substrat nahe. Eine Mutationsstudie zeigte, dass S308A keine nachweisbare Enzymaktivität aufwies, was auf die Schlüsselrolle von Ser308 bei der Katalyse hinweist.

Asn117, Asp116, Leu113, Val119, Lys373 und Arg374 liegen nahe an der 4´-OH-Gruppe am B-Ring des Substrats und steuern wahrscheinlich die Ringmigration. Es wurde berichtet, dass die K375T-Mutante von Lakritze-2-HIS (CYP93C2) die einzige Enzymaktivität zur Produktion von 3-Hydroxyflavanon ohne Ringmigration aufwies27, und der entsprechende Rest ist Lys373 in Medicago 2-HIS. Daher spielt Lys373 eine Schlüsselrolle bei der Arylmigrationsreaktion, möglicherweise durch Wechselwirkung mit dem 4´-OH des Substrats. Allerdings bildet Lys373 auch eine Salzbrücke mit Asp116 in der BC-Schleife, um die Konformation und Position dieses wichtigen Strukturmerkmals zu bestimmen. Eine Mutation von Lys373 würde die Salzbrücke mit Asp116 und auch die Konformation der BC-Schleife zerstören und die 2-HIS-Ringmigrationsaktivität weiter aufheben.

In einem frühen Modell des katalytischen 2-HIS-Mechanismus28 wurde vorgeschlagen, dass das an das Hämeisen gebundene aktivierte Sauerstoffzwischenprodukt zunächst den 3β-Wasserstoff vom C3 des Flavanonsubstrats abstrahiert. Basierend auf der vorliegenden 2-HIS-Struktur kann das Substrat jedoch nicht auf das Häm-Eisen passen, da es sich in einer großen Tasche am Rand des Häms und in der Nähe seiner Propionatgruppen befindet. Der eisengebundene Sauerstoff im aktivierten Sauerstoffzwischenprodukt ist daher zu weit vom Substrat entfernt, um über den vorgeschlagenen gemeinsamen P450-Hydroxylierungsmechanismus direkt in das Substrat eingefügt zu werden.

Ebenso ist das Häm-Eisen in den Strukturen von Peroxidasen, z. B. Meerrettich-Peroxidase (HRP), ebenfalls nicht zugänglich und seine Substrate interagieren mit der δ-meso-Häm-Kante29. HRP fungiert auch als Monooxygenase und der Sauerstoff wird durch Reaktion eines normalen peroxidativen Produkts mit Sauerstoff oder Wasser eingeführt. In der Struktur von 2-HIS ist die Stelle auf der distalen Seite des Häm-Eisens perfekt für die Disauerstoffbindung. An dieser „Sauerstoffbindungsstelle“ kann sich auch ein Hydroxylradikal bilden, eine Art reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die von mikrosomalen P450-Systemen30,31 erzeugt wird; dann könnte 2-HIS möglicherweise einen Ferryl-Sauerstofftransfermechanismus29 nutzen, um Hydroxylradikale auf die „Hydroxylradikal-Übergangsstelle“ in der Nähe der Hämpropionatgruppen unter Ser308 zu übertragen. Das aktivierte Sauerstoffzwischenprodukt kann über die Hämpropionatgruppen mit dem C3-Atom des Substrats interagieren, um den 3β-Wasserstoff zu abstrahieren, gefolgt von der Übertragung des Hydroxylradikals auf das C2-Atom des Substrats nach der Migration des Phenyl-B-Rings von C2 nach C3 (Abb. 6).

a Ringwanderung: Substrat bindet in der Nähe von Hämpropionatgruppen (1); Hämcarboxylat abstrahiert 3β-Wasserstoff, um C3 (2) zu deprotonieren; und der B-Ring bewegt sich von C2 nach C3 (3). b Hydroxylierung: Der Disauerstoff wird an der „Sauerstoffbindungsstelle“ an das Hämeisen gebunden; Nachdem das Hydroxylradikal erzeugt wurde, würde es auf die „Hydroxylradikal-Übergangsstelle“ in der Nähe der Hämpropionatgruppen unter Ser308 übertragen und schließlich nach der Migration des Phenyl-B-Rings von C2 vom aktivierten Sauerstoffzwischenprodukt auf das C2-Atom übertragen bis C3.

Es ist auch möglich, dass das Häm und seine umgebenden Proteinregionen, wie z. B. Helix C, eine Konformationsänderung erfahren und sich in Richtung der Substratbindungstasche bewegen, wenn 2-HIS an NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase und Substrat bindet. Allerdings wird die Substratbindungstasche dann zu klein und flach und das Substrat würde auf der Enzymoberfläche freigelegt (Abb. 5), wenn sich der Häm-Cofaktor an die Stelle bewegt, die für andere bekannte P450-Strukturen charakteristisch ist. Das Spektrum der reduzierten CO-Differenz wurde mit dem 2-HIS-Protein aufgezeichnet und zeigte einen charakteristischen Peak bei 450 nm (ergänzende Abbildung 5a), und das ligandenfreie 2-HIS zeigte ein Soret-Absorptionsmaximum in seinem UV-sichtbaren Spektrum bei 417 nm (ergänzende Abbildung 5b), was bestätigt, dass sich das 2-HIS-Protein in einem nativen Zustand befand. Enzymaktivitätstests wurden auch mit 2-HIS-Enzym aus gelösten Kristallen durchgeführt und zeigten, dass das Enzym katalytisch aktiv war (Abb. 7), was darauf hindeutet, dass die einzigartige Häm-Konformation in den Kristallen kein durch Denaturierung verursachtes Artefakt ist.

Das 2-HIS-Enzym stammte aus gelösten Kristallen und das Substrat Liquiritigenin wurde in 2,7,4'-Trihydroxyisoflavanon umgewandelt, das anschließend zu Daidzein dehydratisiert wurde. Die richtigen Panels sind die HPLC-Profile der authentischen Standards Liquiritigenin und Daidzein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verkürzung der BC- und FG-Schleifen in 2-HIS zu einer tieferen Lage der Substrateintrittsregion führt und die Substratbindungstasche weiter nach unten verschoben wird, wobei der Häm-Cofaktor um etwa 8 Å entfernt wird. Zusammen mit den Unterschieden in Helix I und den Häm-Bindungsregionen erleichtern diese Strukturmerkmale von 2-HIS die Ringmigration, die bei keinem anderen P450 mit bekannter Struktur eine Funktion ist.

Die Kristallstruktur von Kudzu 2-HID wurde mit der molekularen Ersatzmethode mit einer Auflösung von 2,4 Å bestimmt (Tabelle 2). Die Struktur von 2-HID weist eine charakteristische α/β-Hydrolase-Faltung auf, seine Kerndomäne besteht aus einem zentralen achtsträngigen β-Faltblatt mit drei und vier α-Helices auf jeder Seite, und seine N-terminale Region enthält eine dreisträngige β-Faltblattstruktur. gestrandetes β-Faltblatt (Abb. 8 und ergänzende Abb. 6). 2-HID wurde in eine große Familie der Carboxylesterasen eingeordnet, obwohl es sich um eine Dehydratase handelt. Ein Strukturvergleich durch eine DALI-Suche zeigte, dass die 2-HID-Struktur der der pflanzlichen Carboxylesterase AeCXE1 aus Actinidia eriantha32 am ähnlichsten ist (Ergänzende Abbildungen 6–7). Die Überlagerung der Struktur von 2-HID mit der von AeCXE1 (PDB 2O7R) ergab eine starke strukturelle Ähnlichkeit mit einer quadratischen Mittelwertabweichung (rmsd) von 2,6 Å für 290 Cα-Atome und einer Sequenzidentität von 34 % (Ergänzende Abbildungen 6–7). . Der größte Unterschied zwischen diesen beiden Enzymen wurde im N-terminalen Bereich beobachtet, der eine unterschiedliche Konformation aufweist. Die N-terminale Region von AeCXE1 weist nur ein zweisträngiges β-Faltblatt auf, das sich im Vergleich zur entsprechenden Region von 2-HID um ca. 40–60° dreht. Weitere Unterschiede wurden in einer Region vor der Helix α5 beobachtet (ergänzende Abbildung 8).

Die α-Helices, β-Stränge sowie die N- und C-Termini sind markiert.

Obwohl die Cokristallisation von 2-HID mit verschiedenen Substraten und Analoga untersucht wurde, wurde nur eine Struktur von 2-HID im Komplex mit p-Nitrophenol, einem Produkt der Carboxylesterase-Reaktion, erhalten und eine genau definierte Elektronendichte für den Liganden beobachtet ( Abb. 9a). Der Ligand befindet sich in einer Tasche (Abb. 9a, b), die durch die Schleifen β1-β2 (P16-L17) und β3-β4 (L29-S31) im N-terminalen Bereich, Helix α5 (L222-V226), gebildet wird. Schleife β10-α4 (D269-F271) und Helix α7 (H301-F306), einschließlich vieler hydrophober Reste (z. B. Leu17, Leu29, Ala85, Leu222, Ala223, Val226, Phe203, Phe271 und Phe305). Unten befinden sich Thr168 und Ser169 in der Helix α4 und ein glycinreiches Motiv, Gly83-Gly84-Ala85, in der Schleife β6-α1. In der Tasche befinden sich mehrere geladene Reste, darunter Glu89, Asp269, Glu270 und His301, die möglicherweise wichtige funktionelle Rollen spielen. Die Lage dieser Tasche ähnelt der der Substratbindungstasche, die in der Struktur der Carboxylesterase AeCXE132 identifiziert wurde, und ähnelt auch der Gibberellin (GA)-Bindungstasche, die in der Struktur des Gibberellinrezeptors GID133 beobachtet wird. Im Vergleich zu AeCXE1 sind das aktive Zentrum und die Substratbindungstasche von 2-HID relativ offen und groß (ergänzende Abbildung 8). In den Strukturen von AeCXE1 und GID1 sind die Schleifen vor der Helix α5 relativ lang, mit vier weiteren Aminosäuren, und bedecken die Oberseite und bilden eine Seite der Substratbindungstasche. In der 2-HID-Struktur befindet sich diese Schleife vom aktiven Zentrum entfernt; Dies könnte in eine geschlossene Konformation geändert werden, wenn das Substrat an das Enzym bindet.

eine 2Fo-Fc-Elektronendichtekarte bei 1,0 σ für p-Nitrophenyl (NPO) und eine katalytische Triade, Thr168, Asp269 und His301 für die Carboxylesterase-Aktivität; b Aktives Zentrum von 2-HID, angedockt an das Substrat 2,7,4´-Trihydroxyisoflavanon, nahe der katalytischen Säure Glu89 und der katalytischen Base His301. Schlüsselreste, die an der Substratbindung beteiligt sind, werden als Bindungsmodelle dargestellt und je nach Element eingefärbt: Sauerstoff, rot; Stickstoff, blau; und Kohlenstoff, Cyan. NPO und 2,7,4'-Trihydroxyisoflavanon sind ebenfalls als Bindungsmodelle mit ihren Kohlenstoffatomen in Gelb dargestellt.

Die N-terminale Region ist auch ein wichtiger Teil der Substratbindungstasche. Bei 2-HID bildet ein Ende des dreisträngigen β-Faltblatts, einschließlich Pro16, Leu17, Leu29 und Ser31, eine große Seite der Substratbindungstasche. In AeCXE1 wurden nur zwei β-Stränge in der entsprechenden N-terminalen Region beobachtet und befinden sich in einer anderen Ausrichtung (ergänzende Abbildung 7), wobei sich der N-terminale Endabschnitt zum aktiven Zentrum hin faltet und den Eingang im Vergleich zu kleiner macht 2-HID-Struktur. In GID1 sind zwei Helices im N-Terminus vor den beiden β-Strängen vorhanden und werden verlängert, um den Eingang der GA-Bindungsstelle abzudecken.

Das aktive Zentrum von AeCXE1 wurde in der Substratbindungstasche mit den drei katalytischen Triadenresten Ser169, Asp276 und His306 identifiziert. In der Struktur von GID1 wurde die entsprechende Stelle als GA-Bindungsstelle mit zwei konservierten Carboxylesterase-aktiven Resten Ser191 und Asp289 identifiziert, wobei His durch Val319 ersetzt wurde. Sequenz- und Strukturvergleichsstudien mit AeCXE1 zeigten, dass 2-HID zwei entsprechende katalytische Triadenreste Asp269 und His301 besitzt und das katalytische Ser durch Thr168 ersetzt ist. Diese drei Reste können auch die katalytische Triade für die 2-HID-Carboxylesterase-Funktion bilden. Wie in der Struktur des Komplexes von 2-HID mit Ligand beobachtet, bildet p-Nitrophenol eine Wasserstoffbrücke mit Thr168, das als nukleophiler Rest für AeCXE1 angesehen wird. Sein Esterhydrolysemechanismus ähnelt dem von AeCXE1 und anderen Carboxylesterasen, und die nukleophile Hydroxylgruppe von Thr168 in der katalytischen Triade fungiert als Katalysator. In der 2-HID-Struktur befindet sich jedoch das CG2-Atom von Thr168 in der Nähe von His301 und sein OG1-Atom zeigt auf eine andere Seite und bildet eine Wasserstoffbrücke mit p-Nitrophenol. Die Orientierung und Konformation von His301 in 2-HID unterscheidet sich ebenfalls geringfügig von denen von His306 in AeCXE1. Darüber hinaus liegt Ser169 in 2-HID auch in der Nähe von p-Nitrophenol und könnte mit dem Substrat interagieren, wohingegen der entsprechende Rest in AeCXE1 Ala170 ist.

Die 2-HID-Mutanten D269A, H301A und T168A hatten keine oder nur eine schwache Carboxylesterase-Aktivität auf das p-Nitrophenylvalerat, und die Aktivität der Mutante S169A war auf 52 % der Aktivität des Wildtyp-Enzyms reduziert (Tabelle 3). In ähnlicher Weise verloren die Sojabohnen-2-HID-Mutanten D263N und H295A die Carboxylesterase-Aktivität, und die Aktivität der Mutanten T164A und T164S wurde auf 1–3 % des Wildtyp-Enzyms reduziert8. Diese Studien legen nahe, dass Thr168, Asp269 und His301 eine katalytische Triade ähnlich der von AeCXE1 bilden könnten und Ser169 möglicherweise auch eine Rolle bei der Katalyse der Carboxylesterase-Funktion spielt.

Es ist wahrscheinlich, dass His301 als katalytische Base zur Abstraktion eines Wasserstoffs an C3 des Substrats fungiert und eine ähnliche katalytische Rolle bei der Dehydratisierung spielt. Molekulares Andocken zeigte, dass Glu89 nahe am Substrat liegt und seine Seitenkette mit der C2-Hydroxylgruppe des Substrats interagieren kann (Abb. 9b und ergänzende Abb. 8). Glu89 ist in der 2-HID-Enzymfamilie hoch konserviert, Phe97 und Ser127 sind jedoch an der entsprechenden Position in den Strukturen von CXE1 bzw. GID1 vorhanden. Dieses Glu89 in 2-HID kann als Säure wirken, um die Hydroxylgruppe zu protonieren und zu abstrahieren, um die Entfernung von Wasser aus dem Substrat abzuschließen. Die Mutationen H301A, E89A und E89Q haben die Dehydratisierungsaktivität vollständig aufgehoben, aber E89A und E89Q hatten immer noch Carboxylesterase-Aktivität, etwa 23 % bzw. 50 % der Wildtyp-Enzymaktivität (Tabelle 3). Somit spielen sowohl His301 als auch Glu89 eine wesentliche Rolle für die Dehydratase-Funktion, und His301, jedoch nicht Glu89, ist auch für die Carboxylesterase-Funktion essentiell.

Zwei Arten von 2-HID wurden charakterisiert: Das Enzym aus G. echinata ist spezifisch für die 4'-O-methylierten 2-Hydroxyisoflavanone und wird als HIDM (d. h. Methoxy-Typ) bezeichnet, und das Sojabohnenenzym weist eine breitere Spezifität für beide auf 4'-hydroxylierte und -O-methylierte Substrate und wird als HIDH (dh Hydroxy-Typ)8 bezeichnet.

Sequenzvergleiche und Strukturanalysen zeigten, dass Aminosäuren, die die Substratbindungstaschen bilden, in P. lobata 2-HID, Sojabohnen-HIDH und G. echinata HIDM hoch konserviert sind. Es gibt jedoch einige geringfügige Unterschiede in der Substratbindungstasche. P. lobata 2-HID hat Ser31, Leu222, Ala302, Phe306, Sojabohnen-GmHIDH hat die gleichen Reste an den entsprechenden Positionen, aber G. echinata GeHIDM hat Gly34, Ser225, Cys305 und Tyr309.

Molekulares Andocken zeigte, dass die 4´-Hydroxylgruppe von 2-Hydroxyisoflavanon im einzelnen P. lobata 2-HID in die Nähe von Ser31 und Phe306 zeigt (Abb. 9b und ergänzende Abb. 8), was dem Sojabohnenenzym ähnelt und eine breitere Spezifität aufweisen sollte zur Bildung sowohl der 4′-hydroxylierten als auch der -O-methylierten Isoflavone, die in diesem P. lobata vorkommen34. In GeHIDM entspricht Gly34 Ser31 von P. lobata 2-HID. Ein Substrat mit einer 4´-Methoxygruppe würde gut in die große hydrophobe GeHIDM-Substratbindungstasche passen.

Zusammenfassend beschreiben wir die Strukturmerkmale von 2-HIS und 2-HID, die zusammen die Eintrittsreaktionen in den Isoflavonoidweg katalysieren. 2-HIS besitzt eine derzeit einzigartige Struktur, die sowohl für die Ringmigration als auch für die Hydroxylierung verantwortlich ist, und 2-HID besitzt zwei enzymatische Aktivitäten als Dehydratase und Carboxylesterase und nutzt einen neuen Mechanismus für die Dehydratisierung von Isoflavonen. In Kombination mit unserer früheren Arbeit zur strukturellen Charakterisierung der beiden nachgeschalteten Enzyme Isoflavonreduktase35, Vestitonreduktase36 und der (Iso-)Flavonoid-Glykosyltransferasen UGT85H237 und UGT78G138 bilden diese Strukturen eine Grundlage für die Modifikation und Konstruktion des Isoflavonoid-Biosynthesewegs zur Bildung neuer Isoflavonstrukturen mit verbesserter Bioaktivität.

M. truncatula 2-HIS, dessen N-terminale Transmembrananker durch das Polypeptid MAKKTSSGR ersetzt wurden, wurde in den pCWori+-Vektor mit einem Vier-Histidin-Tag am C-Terminus kloniert. Mit dem Plasmid transformierte E. coli BL21(DE3)-Zellen wurden bei 37 °C in LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM Thiamin und 0,5 mM δ-Aminolävulinsäure gezüchtet, bis A600 nm = 0,3–0,5. Die Kulturen wurden mit 1,0 mM Isopropyl-1-thio-β-galactopyranosid (IPTG) induziert und 2 Tage lang bei 30 °C gezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. Nach der Lyse mit einem EmulsiFlex-C5-Homogenisator (Avestin) und 20-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min bei 4 °C wurde dem Überstand, der die Zielproteine ​​enthielt, Ni2+-NTA-Agarose zugesetzt. Nach 40–60-minütiger Inkubation wurde die Mischung in eine Einwegsäule überführt und ausgiebig mit Lysepuffer gewaschen. Die His-markierten Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 10 mM β-Mercaptoethanol) eluiert. Das Protein wurde auf einer Superdex-200-Gelfiltrationssäule (Amersham Pharmacia Biotech) weiter gereinigt und in 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 5 mM β-Mercaptoethanol auf 5 mg/ml konzentriert.

Mit Selenomethionin (SeMet) substituiertes 2-HIS wurde hergestellt, indem das rekombinante Protein in E. coli B834 (DE3)-Zellen (Novagen) exprimiert wurde, die in M9-Minimalmedium, ergänzt mit SeMet, gemäß der beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen gezüchtet wurden39. Das Verfahren zur Expression und Reinigung ähnelte dem oben für das native Protein beschriebenen Verfahren.

2-HID aus Kudzu wurde in den Vektor pDEST17 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) (Novagen) transformiert. E. coli-Zellen wurden bei 37 °C in LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin gezüchtet, bis A600 nm = 0,6–0,8. Nach der Induktion mit 0,25 mM IPTG wurden die Kulturen über Nacht bei 16 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 5.000 U/min geerntet und bis zur Reinigung bei –80 ° C gelagert. Zellpellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 20 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. Nach der Lyse mit einem EmulsiFlex-C5-Homogenisator (Avestin) und 20-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min bei 4 °C wurde dem Überstand, der die Zielproteine ​​enthielt, Ni2+-NTA-Agarose zugesetzt. Nach 40–60-minütiger Inkubation wurde die Mischung in eine Einwegsäule überführt und ausgiebig mit dem Lysepuffer gewaschen (ca. 50 Säulenvolumina). Die His-markierten 2-HID-Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 20 mM β-Mercaptoethanol) eluiert. Die Proteine ​​wurden mit Resource Q- und Superdex-200-Gelfiltrationssäulen (Amersham Pharmacia Biotech) weiter gereinigt und in 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 5 mM β-Mercaptoethanol auf 20 mg/ml konzentriert.

Ortsspezifische Mutanten von 2-HIS und 2-HID wurden unter Verwendung der QuikChange-Strategie (Stratagene) konstruiert. Die mutierten Proteine ​​wurden unter Verwendung der Verfahren für native Proteine ​​exprimiert und gereinigt.

Die 2-HIS-Aktivitäten von Wildtyp- und mutierten Enzymen sowie gelösten 2-HIS-Kristallen wurden hauptsächlich nach einer beschriebenen Methode27,40 bestimmt. Eine 300-µl-Reaktionsmischung enthielt 0,1 M K2HPO4, pH 8,0, 0,4 M Saccharose, 0,5 mM Glutathion, 3 mM NADPH, 160 µM Liquiritigenin oder Naringenin und etwa 4 mg Mikrosomen, die Arabidopsis thaliana NADPH-P450-Reduktase ATR1 enthielten, hergestellt aus transformierten Hefe-WAT11-Zellen mit pYeDP60 vector41. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 µg Protein oder Kristallen gestartet und nach 12-stündiger Inkubation bei 16 °C und 1-stündiger Säurebehandlung mit 10 % (v/v) HCl bei Raumtemperatur mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft und die HPLC-Analyse des Produkts mit einer Waters Spherisorb 5 μ ODS2 C18 Umkehrphasensäule (250 × 4,6 mm) auf einem Agilent HP1100 HPLC, ausgestattet mit einem Autosampler, einer quaternären Pumpe und einem Diodenarray, durchgeführt Detektor. Sowohl das Substrat Liquiritigenin als auch das Produkt Daidzein wurden durch HPLC-Analyse authentischer Standards und Vergleich der Absorptionsspektren und Retentionszeiten verifiziert.

Die Dehydrataseaktivität von 2-HID wurde gemäß einer beschriebenen Methode8 mit einigen Modifikationen bestimmt. Eine 300-µl-Reaktionsmischung enthielt 0,1 M K2HPO4, pH 8,0, 0,4 M Saccharose, 0,5 mM Glutathion, 3 mM NADPH, 300 µM Liquiritigenin und etwa 5 mg Mikrosomen, die A. thaliana NADPH-P450-Reduktase AtATR1 enthielten, hergestellt aus Hefe-WAT11-Zellen, die mit transformiert wurden M. truncatula 2-HIS pYeDP60-Vektor. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Ethylacetat nach 2-stündiger Inkubation bei 30 °C beendet. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, bis er trocknete, und die Reaktionsprodukte wurden in Reaktionspuffer (100 mM Phosphat, pH 8,0) in verschiedenen Konzentrationen als 2-HID-Substrate resuspendiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 µg gereinigter Wildtyp- oder mutierter 2-HID-Proteine ​​gestartet und in einem Endvolumen von 100 µl mit dem Reaktionspuffer inkubiert. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 30 °C durchgeführt und dann durch Zugabe von 100 µl Methanol beendet. Die Lösung wurde 20 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert und 100 µl Lösung wurden für die HPLC-Analyse wie oben injiziert.

Die 2-HID-Carboxylesterase-Aktivität wurde gegen p-Nitrophenylvalerat gemessen. Eine Reaktionsmischung bestehend aus 50 mM PBS-Puffer, pH 7,1 und 1 mM Substrat mit 1 % Acetonitril als Lösungsmittel in einem Endvolumen von 100 µl. Die Reaktion wurde durch Zugabe von etwa 40 ng – 10 µg 2-HID-Wildtyp- oder mutierten Proteinen gestartet. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 40 °C durchgeführt und dann durch Zugabe von 100 µl Methanol beendet. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 12.000 g wurde der Überstand (100 µl) wie oben beschrieben einer HPLC-Analyse unterzogen.

Kristalle von 2-HIS wurden aus hängenden Tropfen durch die Dampfdiffusionsmethode gezüchtet. 2-HIS-Protein in einer Konzentration von 5 mg/ml wurde mit einem gleichen Volumen einer Reservoirlösung gemischt, die 200 mM (NH4)2SO4, 200 mM dibasisches Ammoniumtartrat, 50 mM Imidazol, 1 % FOS-Cholin-8, 30 % ( w/v) PEG3350 und 0,1 M K2HPO4/NaH2PO4 (pH 6,8). Die Mischung wurde über der Reservoirlösung bei 20 °C äquilibriert. Es wurden zwei verschiedene Kristallformen erhalten. Se-Met-Derivatkristalle wurden unter ähnlichen Bedingungen gezüchtet, wobei 1 % FOS-Cholin-8 durch 1 % NDSB-221 ersetzt wurde.

Vor der Datenerfassung wurden die Kristalle auf –180 °C blitzgekühlt. Daten von einem nativen 2-HIS-Proteinkristall wurden mit einem ADSC Quantum 315 CCD-Detektor an der SBC 19ID-Strahllinie der Advanced Photon Source auf 2,0 Å gemessen. Der 2-HIS-Kristall gehörte zur Raumgruppe P21 (a = 49,8 Å, b = 73,2 Å, c = 148,4, β = 93,3°). Es gab zwei Moleküle pro kristallographischer asymmetrischer Einheit mit einem Lösungsmittelgehalt von 47,7 % und einer VM von 2,4 Å3/Da. Ein 3,0 Å MAD-Datensatz von einem SeMet-Derivatkristall mit zwei Wellenlängen wurde an der Strahllinie BL9-2 der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) mit einem MAR325 CCD-Detektor gesammelt. Der Kristall gehörte zu einer anderen Raumgruppe P212121 (a = 73,8 Å, b = 96,0 Å, c = 154,6 Å).

Kristalle von P. lobata 2-HID wurden mithilfe der Dampfdiffusionsmethode aus hängenden Tropfen gezüchtet. Zwei μl einer 20 mg/ml-Proteinlösung wurden mit 2 μl Reservoirlösung (18 % PEG3350, 0,1 M HEPES pH 7,5) gemischt. Die Mischung wurde über der Reservoirlösung bei 20 °C äquilibriert. Die Kristalle wuchsen innerhalb von 3–5 Tagen auf eine Größe von 0,3 × 0,2 × 0,1 mm. Die Kristalle wurden bei −180 °C schockgefroren. Daten von einem 2-HID-Kristall wurden mit einer herkömmlichen Röntgenquelle (RU-H3R) und einem Raxis IV + +-Bildplattendetektor mit einer Auflösung von 2,4 Å gemessen. Der Kristall gehörte zur Raumgruppe P3121 (a = 101,9 Å, b = 101,9 Å, c = 69,7 Å) mit einem Lösungsmittelgehalt von 42 %. In der kristallographisch asymmetrischen Einheit befand sich ein Molekül.

Kristalle von mit p-Nitrophenol komplexiertem 2-HID wurden durch Cokristallisation erhalten. 2-HID-Protein in einer Konzentration von 20 mg/ml wurde mit p-Nitrophenol gemischt und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde eine Cokristallisation unter denselben Bedingungen durchgeführt, die für das Wildtyp-Enzym identifiziert wurden. Daten des mit p-Nitrophenol komplexierten 2-HID-Kristalls wurden mit einem ADSC Quantum 315 CCD-Detektor an der SBC 19ID-Strahllinie der Advanced Photon Source auf 2,3 Å gemessen. Der Kristall gehörte zur gleichen Raumgruppe P3121 wie der native 2-HID-Kristall.

Alle Datensätze wurden mit dem HKL2000-Softwarepaket42 indiziert, integriert und skaliert.

Die Struktur von 2-HIS wurde mit der Methode der anomalen Multiwellenlängendispersion (MAD) bestimmt. Die MAD-Daten (40–3,0 Å) eines Kristalls in der Raumgruppe P21 wurden mit Auto-Rickshaw43 analysiert, was einen Gesamtgütewert von 0,44 ergab, und ein erstes Modell wurde automatisch erstellt. Dieses Modell wurde als Vorlage verwendet, um die native 2-HIS-Struktur in der Raumgruppe P212121 mithilfe der molekularen Ersatzmethode mit dem Programm PHASER44 zu bestimmen. Der interaktive Modellaufbau und die kristallographische Verfeinerung wurden mit den Programmen COOT45, CNS46 bzw. Phenix Refine47 durchgeführt. Es wurde eine Volumenlösungsmittelkorrektur angewendet. B-Faktoren wurden einzeln für die native Proteinstruktur bei 2,0 Å verfeinert. Wassermoleküle wurden mit Arp/wArp48 hinzugefügt und manuell auf Aufnahme überprüft. In den Modellen wurden die ersten sechs (in Molekül A) oder sieben (in Molekül B) Aminosäurereste im N-Terminus und die letzten neun Reste im C-Terminus in den Molekülen A und B nicht beobachtet, und mehrere Regionen (A97 -107, A284-A288, A422-430, A435-437, B95-107, B227-229, B284-287 und B421-B430) waren ungeordnet.

Die Struktur von P. lobata 2-HID wurde durch molekularen Ersatz unter Verwendung des Programms PHASER44 und einer pflanzlichen Carboxylesterase-AeCXE1-Struktur (PDB-ID: 2O7R) als Suchmodell gelöst. Der interaktive Modellaufbau und die kristallographische Verfeinerung wurden mit den Programmen COOT45, CNS46 bzw. Phenix47 durchgeführt. Es wurde eine Volumenlösungsmittelkorrektur angewendet. B-Faktoren wurden individuell verfeinert. Wassermoleküle wurden mit Arp/wArp hinzugefügt und manuell auf Aufnahme überprüft. Die ersten acht Aminosäurereste im N-Terminus wurden nicht beobachtet.

Zur Überprüfung des Modells wurde das Programm PROCHECK49 verwendet. Alle ϕ-ψ-Torsionswinkel des Rückgrats liegen innerhalb der zulässigen Bereiche des Ramachandran-Diagramms.

Das automatisierte Andockprogramm GOLD50 wurde zum Andocken des Substrats an die aktiven 2-HIS- und 2-HID-Stellen verwendet. Zur Steuerung des Andockvorgangs wurden standardmäßige genetische Algorithmusparameter verwendet. Alle Docking-Berechnungen wurden auf die vorhergesagte Bindungstasche beschränkt, indem das aktive Zentrum mit dem Häm-Cofaktor (für 2-HIS) oder dem Rest His301 (für 2-HID) definiert wurde. Für 2-HID wurde die Position des Liganden in der mit p-Nitrophenol gebundenen Struktur als Referenz verwendet. GOLDscore wurde verwendet, um die Docking-Ergebnisse mit der niedrigsten Energie zu ermitteln. Die Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kontakte zwischen Liganden und Enzym wurden analysiert, um den optimalen Bindungsmodus zu identifizieren. Kleinere manuelle Anpassungen der GOLD-Lösung wurden mit dem Programm COOT vorgenommen.

Die 2-HID-Enzymtests wurden dreifach durchgeführt und die Aktivitätsdaten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Die Proteinreinigungsexperimente für 2-HIS und 2-HID wurden dreimal wiederholt, was nahezu identische Probenmerkmale zeigte. Für die in der Arbeit beschriebenen Strukturen wurden Röntgenbeugungsdatensätze mit 2–5 Kristallen gesammelt und die besten Datensätze mit hoher Beugungsqualität zur Strukturbestimmung und Verfeinerung verwendet. Die Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die beschriebene Kristallstruktur wurden bei der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 8E83 für 2-HIS und 8EA1 und 8EA2 für 2-HID hinterlegt.

Dixon, RA Isoflavonoide: Biochemie, Molekularbiologie und biologische Funktionen. in Comprehensive Natural Products Chemistry (Hrsg. Sankawa, U.) 773–823 (Elsevier, 1999).

Dixon, RA & Ferreira, D. Interessante Moleküle: Genistein. Phytochemistry 60, 205–211 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dixon, RA & Sumner, LW Natürliche Hülsenfruchtprodukte: Komplexe Wege für die Gesundheit von Mensch und Tier verstehen und manipulieren. Pflanzenphysiologie. 131, 878–885 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palevitz, BA Sojabohnen kommen auf die Hauptstraße. Wissenschaftler 14, 8–9 (2000).

Google Scholar

Banerjee, S., Li, Y., Wang, Z. & Sarkar, FH Multi-Targeted Therapy of Cancer by Genistein. Krebs Lett. 269, 226–242 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar, FH & Li, Y. Die Rolle von Isoflavonen bei der Chemoprävention von Krebs. Front Biosci. 9, 2714–2724 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dixon, RA & Steele, CL Flavonoide und Isoflavonoide – eine Goldgrube für Metabolic Engineering. Trends Pflanzenwissenschaft. 4, 394–400 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Akashi, T., Aoki, T. & Ayabe, S. Molekulare und biochemische Charakterisierung der 2-Hydroxyisoflavanon-Dehydratase. Beteiligung von Carboxylesterase-ähnlichen Proteinen an der Biosynthese von Leguminosen-Isoflavonen. Pflanzenphysiologie. 137, 882–891 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akashi, T., Aoki, T. & Ayabe, S. Klonierung und funktionelle Expression einer Cytochrom-P450-cDNA, die für die 2-Hydroxyisoflavanon-Synthase kodiert, die an der Biosynthese des Isoflavonoid-Skeletts in Süßholz beteiligt ist. Pflanzenphysiologie. 121, 821–828 (1999).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steele, CL, Gijzen, M., Qutob, D. & Dixon, RA Molekulare Charakterisierung des Enzyms, das die Arylmigrationsreaktion der Isoflavonoid-Biosynthese in Sojabohnen katalysiert. Bogen. Biochem. Biophys. 367, 146–150 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deavours, BE & Dixon, RA Metabolisches Engineering der Isoflavonoid-Biosynthese in Luzerne (Medicago sativa L.). Pflanzenphysiologie. 138, 2245–2259 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hakamatsuka, T., Mori, K., Ishida, S., Ebizuka, Y. & Sankawa, U. Reinigung von 2-Hydroxyisoflavanon-Dehydratase aus den Zellkulturen von Pueraria lobata. Phytochemistry 49, 497–505 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Shimamura, M. et al. 2-Hydroxyisoflavanon-Dehydratase ist ein entscheidender Faktor für die Isoflavonproduktivität in Haarwurzelkulturen von Lotus japonicus. Pflanzenzellphysiologie. 48, 1652–1657 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bolwell, GP, Bozak, K. & Zimmerlin, A. Pflanzliches Cytochrom P450. Phytochemistry 37, 1491–1506 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schuler, MA & Werck-Reichhart, D. Funktionelle Genomik von P450s. Annu Rev. Plant Biol. 54, 629–667 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mizutani, M. & Ohta, D. Diversifizierung von P450-Genen während der Landpflanzenevolution. Annu Rev. Plant Biol. 61, 291–315 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, L., Chang, Z., Pan, Z., Fu, ZQ & Wang, X. Modi der Hämbindung und des Substratzugangs für Cytochrom P450 CYP74A, offenbart durch Kristallstrukturen der Allenoxidsynthase. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 105, 13883–13888 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, DS, Nioche, P., Hamberg, M. & Raman, CS Strukturelle Einblicke in die Evolutionswege von Oxylipin-Biosyntheseenzymen. Natur 455, 363–368 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, B. et al. Struktur und Funktion der Cytochrom-P450-Monooxygenase-Cinnamat-4-Hydroxylase aus Sorghum bicolor. Pflanzenphysiologie. 183, 957–973 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, M. et al. Kristallstruktur von CYP76AH1 im 4-PI-gebundenen Zustand aus Salvia miltiorrhiza. Biochem Biophys. Res Komm. 511, 813–819 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fujiyama, K. et al. Strukturelle Einblicke in einen Schlüsselschritt der Brassinosteroid-Biosynthese und seine Hemmung. Nat. Pflanzen. 5, 589–594 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Niu, G. et al. Strukturelle Basis für die Biosynthese von pflanzlichem Lutein aus α-Carotin. Proz. Natl Acad. Sci. 117, 14150–14157 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, EF & Stout, CD Strukturelle Vielfalt eukaryontischer Membran-Cytochrome P450. J. Biol. Chem. 288, 17082–17090 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, PA et al. Kristallstruktur von menschlichem Cytochrom P450 2C9 mit gebundenem Warfarin. Natur 424, 464–468 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wester, MR et al. Die Struktur von menschlichem Cytochrom P450 2C9 im Komplex mit Flurbiprofen bei einer Auflösung von 2,0 A. J. Biol. Chem. 279, 35630–35637 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Werck-Reichhart, D. & Feyereisen, R. Cytochromes P450: eine Erfolgsgeschichte. Genombiol. 1, 1–9 (2000). Bewertungen3003.

Artikel Google Scholar

Sawada, Y., Kinoshita, K., Akashi, T., Aoki, T. & Ayabe, S. Wichtige Aminosäurereste, die für die Arylmigration erforderlich sind, die durch die Cytochrom P450-2-Hydroxyisoflavanon-Synthase katalysiert wird. Plant J. 31, 555–564 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hashim, MF, Hakamatsuka, T., Ebizuka, Y. & Sankawa, U. Reaktionsmechanismus der oxidativen Umlagerung von Flavanon in der Isoflavon-Biosynthese. FEBS Lett. 271, 219–222 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ortiz de Montellano, PRR Katalytische Stellen von Hämoproteinperoxidasen. Annu Rev. Pharm. Toxicol. 32, 89–107 (1992).

Artikel CAS Google Scholar

Yasui, H., Hayashi, S. & Sakurai, H. Mögliche Beteiligung von Singulett-Sauerstoffspezies als mehrfache Oxidationsmittel an katalytischen P450-Reaktionen. Arzneimittel-Metabol. Pharmakokinet. 20, 1–13 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ortiz de Montellano, PR Kohlenwasserstoffhydroxylierung durch Cytochrom P450-Enzyme. Chem. Rev. 110, 932–948 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ileperuma Marshall, SD et al. Hochaufgelöste Kristallstruktur der pflanzlichen Carboxylesterase AeCXE1 aus Actinidia eriantha und ihres Komplexes mit einem hochaffinen Inhibitor Paraoxon. Biochemie 46, 1851–1859 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Shimada Ueguchi-Tanaka, M. et al. A. Strukturelle Grundlage für die Gibberellin-Erkennung durch seinen Rezeptor GID1. Natur 456, 520–523.

Artikel PubMed Google Scholar

Adolfo, LM, Rao, X., Alvarez-Hernandez, A. & Dixon, RA Bewertung der Wege zum C-Glycosyl-Isoflavon Puerarin in Wurzeln von Kudzu (Pueraria lobata). Plant Direct.6 6, 442 (2022).

Google Scholar

Wang, X. et al. Kristallstruktur der Isoflavonreduktase aus Luzerne (Medicago sativa L.). J. Mol. Biol. 358, 1341–1352 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shao, H., Dixon, RA & Wang, X. Kristallstruktur der Vestitonreduktase aus Luzerne (Medicago sativa L.). J. Mol. Biol. 369, 265–276 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, L. et al. Kristallstruktur von Medicago truncatula UGT85H2 – Einblicke in die strukturellen Grundlagen einer multifunktionalen (Iso)flavonoid-Glycosyltransferase. J. Mol. Biol. 370, 951–963 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Modolo, LV, Li, L., Dixon, RA & Wang, X. Kristallstrukturen der Glykosyltransferase UGT78G1 enthüllen die molekulare Basis für die Glykosylierung und Deglykosylierung von (Iso)Flavonoiden. J. Mol. Biol. 392, 1292–1302 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Doublie, S. Herstellung von Selenomethionylproteinen zur Phasenbestimmung. Methoden Enzym. 276, 523–530 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Tian, ​​L. & Dixon, RA Ein künstliches bifunktionelles Enzym zur Manipulation des Isoflavonstoffwechsels in Nicht-Hülsenfruchtpflanzen. Planta 224, 496–507 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pompon, D., Louerat, B., Bronine, A. & Urban, P. Hefeexpression von tierischen und pflanzlichen P450s in optimierten Redoxumgebungen. Meth. Enzym. 272, 51–64 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Verarbeitung von im Oszillationsmodus erfassten Röntgenbeugungsdaten. in Methods Enzymol. (Hrsg. Carter, CW & Sweet, RM) 276, 307–326 (Academic Press, 1997).

Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V., Weiss, M. & Tucker, P. Autorikscha: eine automatisierte Plattform zur Kristallstrukturbestimmung als effizientes Werkzeug zur Validierung eines Röntgenbeugungsexperiments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 449–457 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Read, RJ Mit maximaler Wahrscheinlichkeit die Grenzen des molekularen Ersatzes verschieben. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 57, 1373–1382 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D. 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Brünger, AT et al. Kristallographie- und NMR-System: eine neue Software-Suite zur Bestimmung der makromolekularen Struktur. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. D. 54, 905–921 (1998).

Artikel Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Cryst. D66, 213–221 (2010).

Google Scholar

Lamzin, VS, Perrakis, A. & Wilson, KS Die ARP/WARP-Suite für die automatisierte Konstruktion und Verfeinerung von Proteinmodellen. im Int. Tabellen zur Kristallographie – Kristallographie biologischer Makromoleküle (Hrsg. Rossmann, M. & Arnold, E.) F, 720–722 (Kluwer Academic Publishers, 2001).

Laskowski, RA, MacArthur, MW, Moss, DS & Thornton, JM PROCHECK – ein Programm zur Überprüfung der stereochemischen Qualität von Proteinstrukturen. J. Appl. Kristalllogr. 26, 283–291 (1993).

Artikel CAS Google Scholar

Jones, G., Willett, P., Glen, RC, Leach, AR & Taylor, R. Entwicklung und Validierung eines genetischen Algorithmus für flexibles Andocken. J. Mol. Biol. 267, 727–748 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kraulis, PJ MOLSCRIPT: ein Programm zur Erstellung sowohl detaillierter als auch schematischer Darstellungen von Proteinstrukturen. J. Appl. Kristalllogr. 24, 946–950 (1991).

Artikel Google Scholar

Merritt EA & Bacon, DJ Raster3D: fotorealistische molekulare Grafiken. In Methods in Enzymology (Hrsg. Carter CW und Sweet, RM) 277, 505–524 (Academic Press, 1997).

DeLano, WL Das PyMOL-Benutzerhandbuch. (DeLano Scientific, 2002).

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. L. Pedersen (NIEHS, NIH) für die freundliche Bereitstellung des pCWori+-Vektors, Dr am Stanford Synchrotron Radiation Laboratory und an der Beamline 19ID des Structural Biology Center an der Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory (Argonne, IL), für Unterstützung bei der Datenerfassung. Argonne wird von UChicago Argonne, LLC für das US Department of Energy, Office of Biological and Environmental Research unter dem Vertrag DE-AC02-06CH11357 betrieben. Diese Arbeit wurde vom Noble Research Institute, Conagen LLC (New Bedford, MA) und der University of North Texas unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xiaoqiang Wang, Haiyun Pan.

BioDiscovery Institute und Department of Biological Sciences, University of North Texas, Denton, TX, 76203-5017, USA

Xiaoqiang Wang, Vincent Paris, Chunliu Zhuo und Richard A. Dixon

Conagen, Inc., Bedford, MA, 01730, USA

Haiyun Pan

Abteilung für Genetik und Biotechnologie, Osmania University, Hyderabad, 500007, Indien

Someswar Sagurthi

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Von XW und RAD konzipierte Forschung. HP, XW, SS, VP und CZ führten Untersuchungen durch. HP, XW und SS analysierten die Daten und HP, XW und RAD verfassten das Papier.

Korrespondenz mit Xiaoqiang Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ingrid Span und Luke R. Grinham.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, X., Pan, H., Sagurthi, S. et al. Die Proteinkonformationsbasis der Isoflavon-Biosynthese. Commun Biol 5, 1249 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04222-x

Zitat herunterladen

Eingegangen: 26. Mai 2022

Angenommen: 03. November 2022

Veröffentlicht: 15. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04222-x

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.